Due metodi comuni di osservazione al microscopio
1. Osservazione in campo scuro
L'osservazione in campo scuro utilizza l'illuminazione in campo scuro. A differenza dell’osservazione in campo chiaro, la luce illuminante non viene vista direttamente; viene rilevata solo la luce riflessa o diffratta dal campione. Di conseguenza, il campo visivo ha uno sfondo scuro mentre il campione appare luminoso.
L'osservazione in campo oscuro si basa sull'effetto Tyndall in ottica. Le particelle di polvere sono invisibili all'occhio umano sotto la luce diretta e intensa a causa della diffrazione della luce. Quando la luce colpisce le particelle obliquamente, la riflessione della luce fa sì che le particelle appaiano ingrandite e visibili.
L'accessorio speciale necessario per l'osservazione in campo scuro è un condensatore in campo scuro. Impedisce al fascio luminoso di passare verticalmente verso l'alto attraverso il provino. Invece, reindirizza la luce per illuminare il campione con un angolo obliquo. La luce illuminante non entra direttamente nella lente dell'obiettivo e le immagini luminose sono formate dalla luce riflessa e diffratta dalla superficie del campione. La risoluzione dell'osservazione in campo scuro è di gran lunga superiore a quella dell'osservazione in campo chiaro, raggiungendo 0,02–0,004 μm.
2. Microscopia a contrasto di fase
Nello sviluppo dei microscopi ottici, l'invenzione della microscopia a contrasto di fase rappresenta un risultato importante nella microscopia moderna. L'occhio umano può distinguere solo la lunghezza d'onda (colore) e l'ampiezza (luminosità) delle onde luminose. Per i campioni biologici incolori e trasparenti, la luce passa con pochi cambiamenti nella lunghezza d'onda o nell'ampiezza, rendendoli difficili da osservare in condizioni di campo chiaro.
La microscopia a contrasto di fase esegue l'ispezione in base alla differenza del percorso ottico del campione. Utilizza efficacemente l'interferenza della luce per convertire le differenze di fase (invisibili all'occhio umano) in differenze di ampiezza distinguibili. Anche le sostanze trasparenti incolori possono essere visualizzate chiaramente. Ciò facilita notevolmente l'osservazione delle cellule viventi, quindi la microscopia a contrasto di fase è ampiamente utilizzata con i microscopi invertiti.
Il principio di base del microscopio a contrasto di fase è convertire la differenza del percorso ottico della luce visibile trasmessa attraverso il campione in una differenza di ampiezza, migliorando così il contrasto tra le diverse strutture e rendendole chiaramente visibili. Dopo aver attraversato il campione, la luce si rifrange, devia dal suo percorso originale e viene ritardata di 1/4 di lunghezza d'onda. Un ulteriore ritardo o anticipo di 1/4 di lunghezza d'onda determina una differenza totale del percorso ottico di 1/2 lunghezza d'onda. I due raggi si sovrappongono e interferiscono, aumentando o diminuendo l'ampiezza per migliorare il contrasto. Strutturalmente, il microscopio a contrasto di fase ha due caratteristiche speciali che lo distinguono dai normali microscopi ottici.
