Perché è necessario utilizzare un microscopio confocale?
1. Il microscopio ottico è stato perfezionato grazie agli sforzi e ai miglioramenti dei nostri grandi predecessori. Infatti, il normale microscopio può fornirci bellissime immagini microscopiche in modo facile e veloce. Tuttavia, l'evento che ha rivoluzionato il mondo dei microscopi quasi perfetti è stata l'invenzione del "microscopio confocale a scansione laser". Questo nuovo tipo di microscopio è caratterizzato da un sistema ottico che estrae le informazioni dell'immagine solo dalla superficie su cui è concentrato il fuoco e, variando la messa a fuoco e recuperando le informazioni acquisite nella memoria immagine, è possibile ottenere un'immagine nitida con informazioni 3-dimensionali complete. In questo modo è possibile ottenere facilmente informazioni sulla forma della superficie che non possono essere confermate con un microscopio convenzionale. Inoltre, mentre "l'aumento della risoluzione" e la "profondità di campo più profonda" sono condizioni contrastanti per i microscopi ottici convenzionali, soprattutto ad alto ingrandimento, questo problema viene risolto con i microscopi confocali.
2. Vantaggi del sistema ottico confocale
Diagramma schematico del microscopio confocale laser
Il sistema ottico confocale prevede un'illuminazione puntiforme del campione, mentre anche la luce riflessa viene ricevuta tramite un recettore puntiforme. Quando il campione viene posizionato nel punto focale, quasi tutta la luce riflessa raggiunge il fotorecettore e quando il campione è fuori fuoco, la luce riflessa non può raggiungere il fotorecettore. In altre parole, in un sistema ottico confocale viene emessa solo l'immagine che coincide con il punto focale, mentre i punti e la luce diffusa inutile vengono bloccati.
3. Perché usare un laser?
In un sistema ottico confocale, il campione viene illuminato in un punto e la luce riflessa viene ricevuta da un sensore puntiforme. Pertanto è necessaria una sorgente luminosa puntiforme. I laser sono una sorgente luminosa puntiforme. Nella maggior parte dei casi, la sorgente luminosa per i microscopi confocali è una sorgente luminosa laser. Inoltre, la monocromaticità, la direzionalità e l’eccellente forma del fascio dei laser sono ragioni importanti per la loro diffusa adozione.
4. È possibile l'osservazione in tempo reale basata sulla scansione ad alta velocità.
Per la scansione laser viene utilizzata un'unità di deflessione ottico-acustica (Acoustic Optical Deflector, AO prime) in direzione orizzontale, mentre in direzione verticale viene utilizzato uno specchio di scansione del raggio controllato tramite servoelettronica (Servo Galvano-mirror). Poiché non sono presenti vibrazioni meccaniche nel deflettore AO, è possibile la scansione ad alta velocità e l'osservazione in tempo reale sullo schermo del monitor. L'elevata velocità di questa fotocamera è un elemento molto importante che influisce direttamente sulla velocità di messa a fuoco e sul recupero della posizione.
5. Relazione tra posizione di messa a fuoco e luminosità
In un sistema ottico confocale, il campione viene posizionato correttamente nella posizione focale quando la luminosità è zui grande, davanti e dietro di esso, la sua luminosità sarà nettamente ridotta (Figura 4 linea continua). Questa sensibile selettività del piano focale è il principio alla base dell'orientamento in altezza del microscopio confocale e dell'espansione della profondità di fuoco. Al contrario, i normali microscopi ottici non mostrano alcun cambiamento significativo nella luminosità prima e dopo la posizione focale (linea tratteggiata in Fig. 4).
6. Contrasto elevato, alta risoluzione
In un microscopio ottico convenzionale, la luce riflessa dalla parte fuori fuoco del microscopio interferisce e si sovrappone alla parte focale del microscopio per l'imaging, determinando una diminuzione del contrasto dell'immagine. Al contrario, in un sistema ottico confocale, la luce diffusa all'esterno del punto focale e all'interno dell'obiettivo viene quasi completamente rimossa, producendo immagini con un contrasto molto elevato. Inoltre, il potere risolutivo del microscopio risulta migliorato poiché la luce passa due volte attraverso la lente dell'obiettivo, rendendo più nitida l'immagine puntiforme.
7. Funzione di localizzazione ottica
Nel sistema ottico confocale, la luce riflessa viene schermata dalla microapertura in un punto diverso dal fuoco. Di conseguenza, quando si osserva un campione tridimensionale, l'immagine si forma come se il campione fosse stato tagliato con il punto focale (Fig. 5). Questo effetto è chiamato localizzazione ottica ed è una delle caratteristiche dei sistemi ottici confocali.
