Quali sono i componenti strutturali speciali di un microscopio a fluorescenza?
Il blocco del filtro colorato è una parte importante di un microscopio a fluorescenza e i suoi componenti principali sono costituiti da un primo filtro barriera per la luce di eccitazione, un secondo filtro barriera per la luce di emissione e uno specchio divisore del fascio. I modelli di filtri colorati e i nomi dei vari produttori sono spesso incoerenti.
1. Filtro della luce di eccitazione e filtro della luce di emissione: in base alle caratteristiche della sorgente luminosa e del pigmento fluorescente, vengono solitamente selezionati i seguenti tre tipi di abbinamento per fornire luce di eccitazione entro un determinato intervallo di lunghezze d'onda e consentire alla fluorescenza eccitata dal campione di passare attraverso e raggiungere l'oculare per l'imaging.
Eccitazione UV: il filtro della luce di eccitazione può consentire il passaggio della luce UV e bloccare il passaggio della luce visibile superiore a 400 nm. Il corrispondente filtro di emissione della luce consente il passaggio della luce blu e la luce nel campo visivo appare blu, come quando applicata alla colorazione DAPI.
Eccitazione della luce blu: il filtro della luce di eccitazione può consentire il passaggio della luce blu e bloccare la luce proveniente da altre lunghezze d'onda. Il corrispondente filtro di emissione della luce consente il passaggio della luce verde, come i marcatori di colorazione GFP.
Eccitazione della luce verde: il filtro della luce di eccitazione consente il passaggio della luce verde e blocca la luce proveniente da altre lunghezze d'onda. Il corrispondente filtro di emissione della luce solitamente lascia passare la luce rossa, come nel caso della colorazione con rodamina.
2. Filtro colorato semitrasparente e semiriflettente: la sua funzione è quella di bloccare completamente il passaggio della luce di eccitazione e di rifletterla; Ed emettono luce nell'intervallo di lunghezze d'onda corrispondente. Il suo modello corrisponde al filtro luce di eccitazione e al filtro luce di emissione.
(2) Obiettivo e oculare
È possibile applicare varie lenti dell'obiettivo, ma è meglio scegliere lenti con scala aggiuntiva e riduzione dell'aberrazione cromatica, poiché la loro autofluorescenza è estremamente bassa e le loro prestazioni di trasmissione della luce (gamma di lunghezze d'onda) sono adatte alla fluorescenza. Dato che la luminosità della fluorescenza di un'immagine nel campo del microscopio è direttamente proporzionale al quadrato del rapporto di apertura della lente dell'obiettivo e inversamente proporzionale al suo ingrandimento, per migliorare la luminosità delle immagini in fluorescenza, è necessario utilizzare una lente dell'obiettivo con un rapporto di apertura maggiore. Soprattutto per i campioni con fluorescenza insufficiente, è necessario utilizzare un obiettivo con un rapporto di apertura elevato e un'elevata trasmissione della luce, accompagnato da un oculare con il minor ingrandimento possibile.
(3) Altri dispositivi ottici
Lo strato riflettente di uno specchio è solitamente rivestito di alluminio perché l'alluminio assorbe meno luce ultravioletta e visibile nella regione blu-viola, riflettendone oltre il 90% (mentre l'argento ha una riflettività solo del 70%). Generalmente vengono utilizzati specchi piani. La lente di messa a fuoco, appositamente progettata e realizzata per microscopi a fluorescenza, è realizzata in vetro di quarzo o altro vetro che trasmette la luce ultravioletta. Il dispositivo a luce cadente, oltre ad avere la funzione di sorgente luminosa trasmissiva, è più adatto per l'osservazione diretta di campioni opachi e semi trasparenti, come piastre spesse, membrane filtranti, colonie batteriche, colture di tessuti e altri campioni. Negli ultimi anni, molti nuovi tipi di microscopi a fluorescenza sono stati sviluppati utilizzando un dispositivo a luce cadente, noto come microscopio a fluorescenza a luce cadente.
(4) Sorgente luminosa
Al giorno d'oggi, come sorgenti luminose vengono comunemente utilizzate lampade al mercurio ad alta-pressione da 50 o 100 W. Durante il funzionamento, tra due elettrodi avviene una scarica che provoca l'evaporazione del mercurio e un rapido aumento della pressione all'interno della sfera (questo processo richiede solitamente circa 5-15 minuti). Durante questo processo vengono emessi quanti di luce e la lunghezza d'onda della luce rilasciata è sufficiente per eccitare varie sostanze fluorescenti. Pertanto, è ampiamente utilizzato nei microscopi a fluorescenza.
La durata delle lampade al mercurio è relativamente breve, solitamente 200 ore. In risposta a questa limitazione della durata, negli ultimi anni è stato ampiamente utilizzato un nuovo tipo di sorgente luminosa fluorescente X-Cite con una durata della lampadina estremamente lunga di 2000 ore e un utilizzo flessibile - senza preriscaldamento richiesto, pronta all'uso.
