Il principio e le caratteristiche strutturali della microscopia a fluorescenza
La microscopia a fluorescenza utilizza un punto con un'elevata efficienza luminosa per emettere una certa lunghezza d'onda della luce (come luce ultravioletta 3650 pollici o luce viola blu 4200 pollici) attraverso un sistema di filtraggio del colore come luce di eccitazione ed eccita le sostanze fluorescenti nel campione per emettere vari colori di fluorescenza. Successivamente, viene osservato attraverso l'ingrandimento della lente dell'obiettivo e dell'oculare. In questo modo è facile riconoscere anche quando la fluorescenza è molto debole su uno sfondo forte, con elevata sensibilità. Viene utilizzato principalmente per lo studio della struttura e della funzione delle cellule, nonché della composizione chimica. La struttura di base di un microscopio a fluorescenza è composta da un normale microscopio ottico più accessori come una sorgente di luce fluorescente, un filtro di eccitazione, un separatore di fascio dicroico e un filtro di blocco. Le sorgenti luminose fluorescenti generalmente utilizzano lampade al mercurio ad altissima pressione (50-200W), che possono emettere luce di varie lunghezze d'onda. Tuttavia, ciascuna sostanza fluorescente ha una lunghezza d'onda della luce di eccitazione che produce la fluorescenza più forte, quindi è necessario aggiungere filtri di eccitazione (tipicamente filtri di eccitazione ultravioletti, viola, blu e verdi) per consentire solo a una certa lunghezza d'onda della luce di eccitazione di penetrare e irradiare il campione, mentre assorbe tutta l'altra luce. Dopo essere stata irradiata dalla luce di eccitazione, ogni sostanza emette una fluorescenza visibile più lunga della lunghezza d'onda dell'irradiazione in un tempo molto breve. La fluorescenza ha specificità ed è generalmente più debole della luce di eccitazione. Per osservare una fluorescenza specifica, è necessario aggiungere un blocco (o soppressione) dietro la lente dell'obiettivo e utilizzarlo in combinazione.
Differenza tra microscopio a fluorescenza e microscopio ordinario
1. Il metodo di illuminazione è solitamente del tipo a fascio discendente, in cui la sorgente luminosa viene proiettata sul campione attraverso una lente obiettiva;
2. La sorgente luminosa è la luce ultravioletta, con una lunghezza d'onda più corta e una risoluzione maggiore rispetto ai normali microscopi;
3. Esistono due filtri speciali, quello davanti alla sorgente luminosa viene utilizzato per filtrare la luce visibile e quello tra l'oculare e l'obiettivo viene utilizzato per filtrare i raggi ultravioletti per proteggere l'occhio umano.
La microscopia a fluorescenza è anche un tipo di microscopia ottica, con la differenza principale che sono le diverse lunghezze d'onda di eccitazione. Ciò determina le differenze di struttura e utilizzo tra la microscopia a fluorescenza e la normale microscopia ottica.
La microscopia a fluorescenza è uno strumento di base per la citochimica dell'immunofluorescenza. È composto da componenti principali come una sorgente luminosa, un sistema di piastre filtranti e un sistema ottico. Utilizza una certa lunghezza d'onda della luce per eccitare il campione in modo che emetta fluorescenza e lo ingrandisce attraverso una lente dell'obiettivo e un sistema di oculari per osservare l'immagine fluorescente del campione.
