La differenza tra microscopio a fluorescenza (a due fotoni, confocali) e microscopio ordinario
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è che ad alta densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire simultaneamente due fotoni a lunghezza d'onda lunga ed emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta dopo un breve periodo di cosiddetta durata dello stato eccitato; L'effetto è lo stesso dell'uso di un fotone con metà della lunghezza d'onda della lunghezza d'onda lunga per eccitare le molecole fluorescenti. Due eccitazione dei fotoni richiedono un'alta densità di fotoni e, per evitare le celle dannose, la microscopia a due fotoni utilizza laser a impulsi bloccati in modalità ad alta energia. Il laser emesso da questo laser ha un'energia di picco elevata e una bassa energia media, con una larghezza di impulso di soli 100 femtosecondi e una frequenza fino a 80 a 100 megahertz. Quando si utilizza una lente oggettiva ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni di un laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente oggettiva è la più alta e l'eccitazione a due fotoni si verifica solo nel punto focale della lente oggettiva. Pertanto, il microscopio a due fotoni non richiede un foro stenopeico confocale, che migliora l'efficienza del rilevamento della fluorescenza.
In generale i fenomeni di fluorescenza, a causa della bassa densità del fotone della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone alla volta e quindi emettere un altro fotone fluorescente attraverso la transizione radiativa, che è nota come fluorescenza a singolo fotone. Per i processi di eccitazione della fluorescenza che utilizzano laser come fonti di luce, possono verificarsi fenomeni di fluorescenza a due fotoni o addirittura multifoton. In questo caso, la sorgente di luce di eccitazione utilizzata ha una densità di alta intensità e fotoni che soddisfa il requisito per le molecole fluorescenti per assorbire contemporaneamente due fotoni. Nel processo di utilizzo di un laser generale come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni è ancora insufficiente per produrre un fenomeno di assorbimento a due fotoni. In genere, vengono utilizzati laser a impulsi di femtosecondi, con una potenza istantanea che raggiunge il livello di megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è più corta di quella della luce di eccitazione, equivalente all'effetto prodotto dall'eccitazione della lunghezza d'onda a mezza eccitazione.
Conoscenza correlata alla microscopia a fluorescenza confocale
Il principio di base della microscopia a fluorescenza confocale è quello di utilizzare una sorgente di luce puntuale per irradiare il campione, formando un piccolo punto di luce ben definito sul piano focale. La fluorescenza emessa da questo punto dopo che l'irradiazione viene raccolta dalla lente oggettiva e inviata lungo il percorso di irradiazione originale allo splitter del raggio composto da uno specchio dicroico. Lo spettrometro invia fluorescenza direttamente al rivelatore. C'è un foro stenopeico di fronte sia della sorgente luminosa che del rivelatore, chiamato foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevamento, rispettivamente. Le dimensioni geometriche dei due sono coerenti, approssimativamente 100-200 nm; Rispetto al punto di luce sul piano focale, i due sono coniugato, il che significa che il punto della luce passa attraverso una serie di lenti e alla fine può concentrarsi contemporaneamente sia sul foro stenopeico di illuminazione che sul foro stenopeico di rilevamento. In questo modo, la luce del piano focale può convergere all'interno dell'intervallo del foro di rilevamento, mentre la luce sparsa da sopra o sotto il piano focale è bloccata all'esterno del foro di rilevamento e non può essere ripresa. Scansionando il punto campione per punto con un laser, il tubo fotomultiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene anche la corrispondente immagine confocale del punto luminoso punto per punto, lo converte in un segnale digitale e lo trasmette sul computer e infine la aggrega in una chiara immagine confocale dell'intero piano focale sullo schermo.
