Procedura standard per la calibrazione dei polarizzatori in un microscopio polarizzatore
Il microscopio a fluorescenza è diverso dal normale microscopio ottico in quanto non osserva i campioni sotto l'illuminazione di normali fonti di luce. Utilizza invece una determinata lunghezza d'onda della luce (solitamente luce ultravioletta, luce blu-viola) per eccitare le sostanze fluorescenti all'interno del campione osservato al microscopio, facendole emettere fluorescenza. Pertanto, il ruolo della sorgente luminosa nel microscopio a fluorescenza non è l'illuminazione diretta, ma come fonte di energia per eccitare le sostanze fluorescenti all'interno del campione. Il motivo per cui possiamo osservare i campioni non è dovuto all'illuminazione della sorgente luminosa, ma al fenomeno di fluorescenza esibito dalle sostanze fluorescenti all'interno del campione dopo aver assorbito l'energia luminosa eccitata. Da ciò si può vedere che la caratteristica della microscopia a fluorescenza è principalmente che la sua sorgente luminosa può fornire una grande quantità di luce di eccitazione in un determinato intervallo di lunghezze d'onda, in modo che le sostanze fluorescenti nel campione possano ottenere l'intensità necessaria di luce di eccitazione. Allo stesso tempo, i microscopi a fluorescenza devono essere dotati di corrispondenti sistemi di filtraggio. Il microscopio a fluorescenza è uno strumento fondamentale nella chimica dei tessuti a fluorescenza. È composto da componenti principali come una sorgente luminosa a tensione ultra-, un sistema di filtri (comprese piastre filtranti di eccitazione e soppressione), un sistema ottico e un sistema fotografico. Utilizza la luce di una certa lunghezza d'onda per eccitare il campione ed emettere fluorescenza.
1. Metodi di eccitazione della fluorescenza: in base alla gamma di lunghezze d'onda della luce, esistono due tipi: metodo di eccitazione UV (utilizzando illuminazione ultravioletta) e metodo di eccitazione BV (utilizzando luce blu-viola). Il metodo di eccitazione UV utilizza per l'eccitazione una luce quasi ultravioletta inferiore a 400 nm. Questo metodo non dispone di luce di eccitazione visibile, quindi la fluorescenza osservata mostra la fluorescenza intrinseca del colorante, rendendo facile distinguere la fluorescenza specifica sul campione dall'autofluorescenza del tessuto di fondo.
2. Metodo di eccitazione BV: prevede l'eccitazione dalla luce ultravioletta a quella blu centrata a 404 nm e 434 nm. Questo metodo utilizza la luce blu per irradiare il campione, quindi il filtro di intercettazione-del sistema di osservazione della fluorescenza deve utilizzare un filtro in grado di bloccare completamente la luce blu e di passare completamente attraverso la fluorescenza verde e gialla richiesta. Pigmenti fluorescenti utilizzati per il metodo con anticorpi fluorescenti. La lunghezza d'onda massima di assorbimento della luce di eccitazione e la lunghezza d'onda massima di emissione della fluorescenza sono relativamente vicine, quindi il filtro utilizzato nel metodo di eccitazione BV deve utilizzare un filtro a taglio netto. Questo metodo può utilizzare la luce blu come luce di eccitazione, quindi l'efficienza di assorbimento dei pigmenti fluorescenti è elevata e si possono ottenere immagini più luminose. Lo svantaggio è che la fluorescenza inferiore a 500 nm non può essere vista, mentre la fluorescenza superiore a 500 nm fa apparire gialla l'intera immagine. Nel metodo con anticorpi fluorescenti, la specificità è determinata principalmente dal colore unico dei pigmenti fluorescenti, quindi quando si parla di specificità sottile, gli svantaggi del metodo di eccitazione BV sopra menzionato spesso hanno un impatto significativo.
