Requisiti per la preparazione dei vetrini per microscopio a fluorescenza
(1) Vetrino
Lo spessore della diapositiva deve essere compreso tra 0,8 e 1,2 mm. Se il vetrino è troppo spesso, da un lato assorbirà più luce e dall'altro non permetterà alla luce di eccitazione di raccogliersi sul campione. Il vetrino deve essere liscio, di spessore uniforme e non presentare fluorescenza spontanea evidente. A volte sono necessari vetrini di vetro al quarzo.
(2) Coprire il vetrino
Lo spessore del vetro di copertura è di circa 0,17 mm ed è liscio. Per migliorare la luce di eccitazione, è possibile utilizzare anche un vetro di copertura anti-interferenza. Si tratta di un vetro di copertura appositamente progettato con diversi strati di sostanze (come il fluoruro di magnesio) che hanno diversi effetti di interferenza sulla luce di diverse lunghezze d'onda. Può consentire alla fluorescenza di passare senza intoppi, mentre la luce di eccitazione riflessa può eccitare il campione.
(3) Campione
Le fette di tessuto o altri campioni non devono essere troppo spesse. Se sono troppo spessi, la maggior parte della luce di eccitazione viene consumata nella parte inferiore del campione, mentre la parte superiore osservata direttamente dalla lente dell'obiettivo non viene completamente eccitata. Inoltre, la sovrapposizione cellulare o il mascheramento delle impurità possono influenzare il giudizio.
(4) Agente sigillante
Come agente di montaggio viene comunemente utilizzata la glicerina, che non deve avere fluorescenza spontanea, incolore e trasparente. La luminosità della fluorescenza è relativamente brillante a pH 8,5-9,5 e non è facile svanire rapidamente. Pertanto, come agente sigillante viene comunemente utilizzata una miscela uguale di glicerolo e 0,5 mol/L di tampone carbonato con pH 9,0-9,5.
(5) Olio per specchi
Quando si utilizza un microscopio a fluorescenza in campo scuro e un microscopio a olio per osservare i campioni, è necessario utilizzare olio per specchi. È possibile utilizzare uno speciale olio per specchi non fluorescente oppure è possibile utilizzare glicerolo come sostituto. È possibile utilizzare anche paraffina liquida, ma l'indice di rifrazione è basso e ha un leggero impatto sulla qualità dell'immagine.
