Principio e caratteristiche strutturali dei microscopi a fluorescenza
La sorgente luminosa a fluorescenza utilizza generalmente una lampada al mercurio ad altissima pressione (50–200 W), che emette luce di varie lunghezze d'onda. Tuttavia, ciascuna sostanza fluorescente ha una lunghezza d'onda di eccitazione specifica che genera un'intensa fluorescenza. Per questo motivo, è necessario un filtro di eccitazione (tipicamente disponibile nei tipi ultravioletto, viola, blu e verde) per consentire solo alla luce di eccitazione di una lunghezza d'onda specifica di passare attraverso e irradiare il campione, assorbendo tutte le altre lunghezze d'onda.
Quando irradiata dalla luce di eccitazione, ciascuna sostanza emette fluorescenza visibile con una lunghezza d'onda maggiore rispetto alla luce di eccitazione in un tempo estremamente breve. La fluorescenza è altamente specifica e generalmente più debole della luce di eccitazione. Per osservare questa specifica fluorescenza è necessario installare un filtro barriera (o soppressione) dietro la lente dell'obiettivo. Ha due scopi: in primo luogo, assorbe e impedisce alla luce di eccitazione di entrare nell'oculare per evitare di interferire con l'osservazione della fluorescenza e danneggiare gli occhi; in secondo luogo, trasmette selettivamente una fluorescenza specifica per produrre un colore fluorescente distinto. I due tipi di filtri devono essere selezionati e utilizzati in coppie corrispondenti.
I microscopi a fluorescenza si dividono in due tipologie in base al loro percorso ottico:
1. Microscopio a fluorescenza a luce trasmessa
In questo progetto, la sorgente luminosa di eccitazione passa attraverso il condensatore e il materiale del campione per eccitare la fluorescenza. Viene comunemente utilizzato un condensatore a campo scuro, sebbene sia possibile applicare anche un condensatore standard; lo specchio riflettente è regolato per reindirizzare e irradiare lateralmente la luce di eccitazione sul campione. Questo è un tipo relativamente più vecchio di microscopio a fluorescenza. Il suo vantaggio è la forte fluorescenza a basso ingrandimento, mentre lo svantaggio è che l'intensità della fluorescenza diminuisce all'aumentare dell'ingrandimento. È quindi più adatto per l'osservazione di campioni di materiali più grandi.
2. Microscopio a epifluorescenza
Questo è un tipo di microscopio a fluorescenza moderno e di nuova concezione. A differenza del design a luce trasmessa, la luce di eccitazione viene proiettata verso il basso attraverso la lente dell'obiettivo sulla superficie del campione: la stessa lente dell'obiettivo funge sia da condensatore di illuminazione che da obiettivo di raccolta della fluorescenza. Un divisore di fascio dicroico è installato nel percorso ottico con un angolo di 45 gradi rispetto all'asse ottico. La luce di eccitazione viene riflessa nella lente dell'obiettivo e focalizzata sul campione. La fluorescenza generata dal campione, insieme alla luce di eccitazione riflessa dalle superfici della lente dell'obiettivo e del coprioggetto, entra simultaneamente nella lente dell'obiettivo e ritorna al divisore di fascio dicroico, che separa la luce di eccitazione dalla fluorescenza. La luce di eccitazione rimanente viene quindi assorbita dal filtro barriera.
Sostituendo i blocchi filtro con diverse combinazioni di filtro di eccitazione, divisore di fascio dicroico e filtro barriera, è possibile soddisfare i requisiti per diversi prodotti di reazione fluorescente. I vantaggi di questo tipo di microscopio a fluorescenza includono un'illuminazione del campo uniforme, immagini nitide e un aumento dell'intensità della fluorescenza a ingrandimenti più elevati.
