Principio e applicazione della microscopia a fluorescenza
(1) Il principio e le caratteristiche strutturali del microscopio a fluorescenza: il microscopio a fluorescenza utilizza una sorgente luminosa puntiforme con elevata efficienza luminosa per emettere luce di una certa lunghezza d'onda (come la luce ultravioletta 3650 pollici o la luce blu viola 4200 pollici) attraverso il sistema di filtri come la luce di eccitazione per eccitare il campione. Dopo che la sostanza fluorescente all'interno emette fluorescenza di vari colori, viene osservata attraverso l'ingrandimento della lente dell'obiettivo e dell'oculare. In questo modo, sotto uno sfondo a forte contrasto, anche se la fluorescenza è molto debole, è facile da identificare e ha un'elevata sensibilità. Viene utilizzato principalmente per la ricerca della struttura e della funzione delle cellule e della composizione chimica. La struttura base di un microscopio a fluorescenza è composta da un normale microscopio ottico più alcuni accessori (come una sorgente di luce fluorescente, un filtro di eccitazione, un divisore di fascio bicolore e un filtro di blocco, ecc.). Sorgente luminosa fluorescente - generalmente si usa una lampada al mercurio ad altissima pressione (50-200W), che può emettere luce di varie lunghezze d'onda, ma ogni sostanza fluorescente ha una lunghezza d'onda di eccitazione che produce la fluorescenza più forte, quindi è necessario aggiungere una filtro di eccitazione (generalmente, ci sono filtri di eccitazione ultravioletti, viola, blu e verdi), che consentono solo alla luce di eccitazione di una certa lunghezza d'onda di passare e irradiare il campione, assorbendo altra luce. Dopo che ogni sostanza è stata irradiata dalla luce di eccitazione, emette una fluorescenza visibile con una lunghezza d'onda maggiore rispetto alla lunghezza d'onda dell'irradiazione in un tempo molto breve. La fluorescenza è specifica e generalmente più debole della luce di eccitazione. Per osservare una fluorescenza specifica, è necessario un filtro di blocco (o soppressione) dietro la lente dell'obiettivo. Ha due funzioni: una è quella di assorbire e impedire alla luce di eccitazione di entrare nell'oculare, in modo da non disturbare la fluorescenza e danneggiare gli occhi; l'altro è selezionare e far passare la fluorescenza specifica, mostrando un colore fluorescente specifico. I due filtri devono essere utilizzati insieme.
Esistono due tipi di microscopi a fluorescenza in termini di percorsi ottici:
1. Microscopio a fluorescenza a trasmissione: la sorgente luminosa di eccitazione eccita la fluorescenza attraverso il materiale del campione attraverso la lente del condensatore. Viene comunemente utilizzato un collettore di campo oscuro e un normale collettore può essere utilizzato anche per regolare lo specchio in modo che la luce di eccitazione venga trasmessa e bypassata al campione. Questo è un vecchio microscopio a fluorescenza. Il vantaggio è che la fluorescenza è forte a basso ingrandimento e lo svantaggio è che la fluorescenza diminuisce con l'aumentare dell'ingrandimento. Pertanto, è meglio per osservare materiali campione più grandi.
2. Microscopio a epifluorescenza Questo è un nuovo tipo di microscopio a fluorescenza sviluppato in tempi moderni. La differenza è che la luce di eccitazione cade dalla lente dell'obiettivo alla superficie del campione, cioè la stessa lente dell'obiettivo viene utilizzata come condensatore di illuminazione e lente dell'obiettivo per raccogliere la fluorescenza. È necessario aggiungere un divisore di raggio dicroico nel percorso della luce, che si trova a 45 gradi di distanza dall'uranio leggero. La luce di eccitazione viene riflessa nella lente dell'obiettivo e raccolta sul campione. La fluorescenza generata dal campione e la luce di eccitazione riflessa dalla superficie della lente dell'obiettivo e dalla superficie del vetro di copertura entrano contemporaneamente nella lente dell'obiettivo e ritornano allo splitter del fascio bicolore per rendere la luce di eccitazione separata dalla fluorescenza , la luce di eccitazione residua viene assorbita bloccando i filtri. Se si passa a una combinazione di diversi filtri di eccitazione/divisori di fascio bicolore/filtri di blocco, è possibile soddisfare le esigenze di diversi prodotti di reazione fluorescenti. Il vantaggio di questo tipo di microscopio a fluorescenza è che l'illuminazione del campo visivo è uniforme, l'immagine è chiara e maggiore è l'ingrandimento, più forte è la fluorescenza.
(2) Come utilizzare il microscopio a fluorescenza.
1. Accendi la sorgente luminosa, la lampada al mercurio ad altissima pressione deve riscaldarsi per alcuni minuti per raggiungere il punto più luminoso.
2. Per il microscopio a fluorescenza a trasmissione, il filtro di eccitazione richiesto deve essere installato tra la sorgente luminosa e il condensatore e il filtro di blocco corrispondente deve essere installato dietro la lente dell'obiettivo. I microscopi a epifluorescenza devono inserire il filtro di eccitazione richiesto/il divisore del raggio a doppio colore/gli inserti del filtro di blocco nelle fessure del percorso ottico.
3. Osservare con una lente a basso ingrandimento e regolare il centro della sorgente luminosa in base al dispositivo di regolazione di diversi tipi di microscopi a fluorescenza in modo che si trovi al centro dell'intero punto di illuminazione.
4. Posizionare il foglio campione e osservare dopo la messa a fuoco. Prestare attenzione durante l'uso: non osservare direttamente con il filtro finale, in modo da non causare danni agli occhi; quando si osserva il campione con una lente a olio, deve essere utilizzata una lente a olio speciale senza fluorescenza; dopo che la lampada al mercurio ad alta pressione è stata spenta, non può essere riaccesa immediatamente e deve essere testata. Può essere riavviato dopo 5 minuti, altrimenti sarà instabile e influirà sulla durata della lampada al mercurio.
(3) Osservazione Utilizzando un filtro di luce blu-viola sotto un microscopio a fluorescenza sulla piattaforma di insegnamento, si può vedere che le cellule colorate con colorante fluorescente arancione di acridina allo 0,01%, il nucleo e il citoplasma sono eccitati per produrre due diversi colori di fluorescenza (verde scuro e rosso-arancio).
