Design del microscopio a fluorescenza e campo chiaro a basso costo
La microscopia a fluorescenza è un metodo utilizzato per visualizzare il
In questa guida esaminerò le basi della microscopia a fluorescenza e come costruire tre diversi microscopi a fluorescenza a basso costo. Questi sistemi in genere costano migliaia di dollari, ma recentemente sono stati fatti alcuni sforzi per renderli più accessibili. I progetti che presento qui utilizzano uno smartphone, una DSLR e un microscopio USB. Tutti questi modelli possono essere utilizzati anche come microscopi a campo chiaro.
Passaggio 1: panoramica della microscopia a fluorescenza
Per comprendere i concetti di base della microscopia a fluorescenza, immagina una fitta foresta di notte, con alberi, animali, cespugli e altre foreste viventi. Se fai brillare una torcia nella foresta, vedrai tutte queste strutture e avrai difficoltà a visualizzare animali o piante specifici. Supponiamo che tu sia interessato solo a vedere i cespugli di mirtilli nella foresta. Per fare questo, alleni la lucciola ad essere attratta solo dai cespugli di mirtilli, in modo che quando guardi la foresta, solo i cespugli di mirtilli si illuminino. Potresti dire che usi le lucciole per contrassegnare i cespugli di mirtilli in modo da poter vedere le strutture di mirtilli nella foresta.
In questa analogia, la foresta rappresenta l'intero campione, i cespugli di mirtilli rappresentano le strutture che si desidera visualizzare (ad esempio cellule specifiche o organelli subcellulari) e le lucciole sono composti fluorescenti. Illuminare la sola torcia senza le lucciole è simile alla microscopia in campo chiaro.
Il passo successivo è comprendere la funzione di base dei composti fluorescenti (noti anche come fluorofori). I fluorofori sono in realtà piccoli oggetti (nanoscala) progettati per collegare strutture specifiche in un campione. Assorbono una gamma ristretta di lunghezze d'onda della luce e riemettono un'altra lunghezza d'onda della luce. Ad esempio, un fluoroforo può assorbire la luce blu (ovvero il fluoroforo viene eccitato dalla luce blu) e quindi riemettere luce verde. Questo è solitamente riassunto dagli spettri di eccitazione e di emissione (sopra). Questi diagrammi mostrano la lunghezza d'onda della luce assorbita dal fluoroforo e la lunghezza d'onda della luce emessa dal fluoroforo.
Il design del microscopio è molto simile a quello di un normale microscopio a campo chiaro, con due differenze principali. Innanzitutto, la luce che illumina il campione deve essere alla lunghezza d'onda che eccita il fluoroforo (per l'esempio sopra, la luce è blu). In secondo luogo, il microscopio deve solo raccogliere la luce emessa (luce verde) bloccando la luce blu. Questo perché la luce blu è ovunque, ma la luce verde proviene solo da strutture specifiche del campione. Per bloccare la luce blu, i microscopi di solito hanno qualcosa chiamato filtro passa lungo che lascia passare la luce verde senza luce blu. Ogni filtro passa lungo ha una lunghezza d'onda di taglio. Se la luce ha una lunghezza d'onda maggiore della lunghezza d'onda di taglio, può passare attraverso il filtro. Da qui il nome "passaggio lungo". Le lunghezze d'onda più corte vengono bloccate.
Passaggio 2: modellazione del microscopio con ottica ottica
Questo è un ulteriore passo avanti rispetto ai principi di base della progettazione del microscopio. Non è necessario costruire un microscopio a fluorescenza, quindi puoi saltarlo se non vuoi approfondire l'ottica.
Sia i microscopi a campo chiaro che quelli a fluorescenza possono essere modellati utilizzando l'ottica a raggi. La premessa di base dell'ottica a raggi è che la luce si comporta in modo simile alla luce che si allontana da una sorgente luminosa. Quando ti guardi intorno in una stanza, vedi la luce proveniente dalla luce del sole fuori da una finestra o da una lampadina. La luce viene quindi assorbita o riflessa dagli oggetti nella stanza. Parte della luce riflessa viene diretta verso i tuoi occhi. Se l'oggetto è illuminato, puoi immaginare che ogni punto dell'oggetto emetta luce in tutte le direzioni (sopra). La lente, come la lente dei nostri occhi, focalizza la luce in un punto in modo che possiamo vedere l'oggetto. Senza lente la luce continua a viaggiare verso l'esterno e non forma un'immagine.
Allora come possiamo realizzare sistemi ottici che ingrandiscano piccoli oggetti? Per comprendere il design, è necessario conoscere solo due equazioni: l'immagine della lente sottile e le equazioni di ingrandimento:
1/f=1/si + 1/so
M=-si/così
f è la lunghezza focale dell'obiettivo. Una lunghezza focale più corta significa che l’obiettivo ha un potere di messa a fuoco maggiore.
Lo stesso vale per la distanza degli oggetti; la distanza tra l'obiettivo e l'oggetto (ad esempio un albero).
si è la distanza dell'immagine; la distanza tra l'obiettivo e il punto in cui si forma l'immagine
M è l'ingrandimento; quanto è grande l'immagine rispetto all'oggetto. Per i microscopi, vogliamo aumentare l'ingrandimento.
Per un tutorial completo sull'equazione delle lenti sottili, guarda questo video di Khan Academia. Nella gif sopra, puoi vedere che la distanza con cui l'oggetto si avvicina all'obiettivo aumenta la distanza dell'immagine, che aumenta l'ingrandimento. La linea verticale con due frecce indica l'obiettivo.
