Microscopia laser confocale: caratteristiche e applicazioni
La microscopia confocale a scansione laser (LSCM) è un tipo di microscopio progettato sulla base della tecnologia del fuoco coniugato, ovvero la sorgente di luce laser, il campione da misurare e il rilevatore sono tutti in posizioni coniugate tra loro.
Fondamentale
In un microscopio generale, il piano di osservazione dell'immagine è isolato dal piano assiale adiacente facendo coincidere il piano focale della lente dell'obiettivo con il rilevatore, mentre in un microscopio confocale viene utilizzato un punto luminoso a diffrazione limitata per illuminare il campione e A il foro stenopeico viene utilizzato nel percorso luminoso raccolto nel fuoco coniugato del punto luminoso per filtrare la luce diffusa per creare questo effetto di isolamento e quindi migliorare la risoluzione.
Funzionalità di imaging
Imaging di scansione della sezione ottica
Un'altra caratteristica della microscopia confocale a scansione laser è che si tratta di una tecnologia di imaging a scansione. La tradizionale tecnologia di illuminazione a campo ampio illumina l'intero campione, quindi l'immagine può essere catturata direttamente a occhio nudo o da un rilevatore, ma LSCM utilizza un raggio o raggi focalizzati multipli passano attraverso il campione per scansionare e ottenere l'immagine. L'immagine risultante è chiamata sezione ottica. Quanto segue mostra la differenza tra il tradizionale metodo di illuminazione a campo ampio e il metodo di illuminazione confocale a scansione laser.
Pertanto, un metodo di lavoro effettivo di un moderno microscopio confocale è mostrato nella figura seguente. La luce di eccitazione emessa dal laser passa attraverso uno specchio dicroico e viene scansionata nella direzione x e y del campione attraverso una coppia di galvanometri. L'eccitazione (o riflessione) del campione è La luce entra nel rilevatore PMT attraverso il foro stenopeico e viene registrata, e l'immagine scansionata registrata viene ricostruita da un computer per ricostruire l'immagine reale del campione.
Genera immagini "z-stack" su diversi piani focali
Solo la luce riflessa dallo strato campione coniugato può passare attraverso il piccolo foro nel percorso luminoso di raccolta e le rimanenti riflessioni irrilevanti dello strato campione vengono bloccate dal piccolo foro. Ciò può comportare miglioramenti significativi della risoluzione. Confronto affiancato tra la microscopia a fluorescenza multidimensionale e la microscopia confocale dello stesso campione spesso. Quando una serie di immagini viene scattata su diversi piani focali, possono essere generate immagini comunemente denominate "z-stack", che illustrano i guadagni di risoluzione e contrasto offerti dalla microscopia confocale e le cause alla base di questi guadagni. Si può vedere che l'esame dell'immagine nella parte superiore dello stack con il piano di imaging sopra il tessuto rivela una grande quantità di luce diffusa nell'immagine in fluorescenza, mentre l'immagine al microscopio confocale appare nera. Questa riduzione della PSF assiale risulta direttamente nella differenza di risoluzione osservata sull'interfaccia ottica al centro dello z-stack.
La risoluzione è notevolmente migliorata rispetto all'illuminazione a campo ampio
Nella microscopia a fluorescenza, l'intensità della luce emessa da un singolo punto è descritta dalla funzione di diffusione del punto (PSF) e il suo modello è un disco di Airy. La risoluzione del sistema di fluorescenza può essere descritta dal raggio del disco di Airy, che può essere descritto da L'apertura numerica della lente dell'obiettivo e la lunghezza d'onda della luce di eccitazione determinano
