Conoscenza del microscopio confocale a fluorescenza
Il principio base della microscopia confocale a fluorescenza: una sorgente luminosa puntiforme viene utilizzata per irradiare il campione, formando un piccolo punto luminoso ben definito sul piano focale; la fluorescenza emessa da questo punto dopo l'irradiazione viene raccolta dalla lente dell'obiettivo e rimandata lungo il percorso ottico di irradiazione originario al divisore di fascio costituito da uno specchio cromatico bidirezionale. Il divisore di fascio invia la fluorescenza direttamente al rilevatore. Sia la sorgente luminosa che il rilevatore hanno ciascuno un foro stenopeico davanti a sé, chiamato rispettivamente foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevamento. Entrambi hanno la stessa geometria, circa 100-200 nm, e sono coniugati rispetto al punto luminoso sul piano focale, cioè il punto luminoso passa attraverso una serie di lenti e può infine essere focalizzato su entrambi i corpi illuminanti e fori stenopeici del rilevatore. In questo modo, la luce proveniente dal piano focale può convergere all'interno dell'apertura della sonda, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata all'esterno dell'apertura della sonda e non può essere ripresa. Il laser scansiona il campione punto per punto, e il tubo fotomoltiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene punto per punto anche l'immagine confocale del corrispondente punto luminoso, che viene convertita in un segnale digitale e trasmessa al computer, e infine converge in un chiaro immagine confocale dell'intero piano focale sullo schermo.
Ogni immagine del piano focale è in realtà una sezione trasversale ottica del campione e questa sezione trasversale ottica ha sempre un certo spessore, noto anche come foglio ottico. Poiché l'intensità della luce nel punto focale è molto maggiore di quella nel punto non focale, e la luce sul piano non focale viene filtrata dal foro stenopeico, la profondità di campo del sistema confocale viene approssimata a zero e la scansione lungo la direzione dell'asse Z consente alla tomografia ottica di formare una fetta ottica bidimensionale del campione da osservare nel punto focale. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), è possibile ottenere un'immagine tridimensionale del campione accumulando strati successivi di immagini bidimensionali, che vengono elaborati da un software informatico specializzato.
Ciò significa che il foro stenopeico di rilevamento e quello della sorgente luminosa sono sempre focalizzati nello stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata all'esterno del piano focale non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
Il principio di funzionamento del laser confocale è semplicemente espresso nel fatto che utilizza il laser come sorgente luminosa, sulla base dell'imaging tradizionale del microscopio a fluorescenza, di un dispositivo di scansione laser aggiuntivo e di un dispositivo di messa a fuoco coniugato, attraverso il controllo computerizzato per eseguire il sistema di acquisizione ed elaborazione delle immagini digitali.
