Conoscenza della microscopia a fluorescenza a due-fotoni
Il principio di base dell'eccitazione a due-fotoni è che a un'elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire simultaneamente due fotoni a lunghezza d'onda lunga ed emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta dopo un breve periodo della cosiddetta-durata dello stato eccitato; L'effetto è lo stesso che si ottiene utilizzando un fotone con la metà della lunghezza d'onda della lunghezza d'onda lunga per eccitare le molecole fluorescenti. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni e, per evitare di danneggiare le cellule, la microscopia a due-fotoni utilizza laser a impulsi bloccati ad alta-modalità di energia-. Il laser emesso da questo laser ha un'energia di picco elevata e un'energia media bassa, con una larghezza di impulso di soli 100 femtosecondi e una frequenza fino a 80-100 megahertz. Quando si utilizza una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per mettere a fuoco i fotoni di un laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione di due-fotoni si verifica solo nel punto focale della lente dell'obiettivo. Pertanto, il microscopio a due-fotoni non richiede un foro stenopeico confocale, il che migliora l'efficienza del rilevamento della fluorescenza.
Nei fenomeni di fluorescenza generali, a causa della bassa densità di fotoni della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone alla volta e quindi emettere un altro fotone fluorescente attraverso la transizione radiativa, nota come fluorescenza a fotone singolo. Per i processi di eccitazione della fluorescenza che utilizzano laser come sorgenti luminose, possono verificarsi fenomeni di fluorescenza a due-fotoni o addirittura multifotoni. In questo caso, la sorgente luminosa di eccitazione utilizzata ha un'elevata intensità e una densità di fotoni che soddisfa il requisito delle molecole fluorescenti di assorbire due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo di un laser generale come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni è ancora insufficiente per produrre il fenomeno di assorbimento di due-fotoni. Tipicamente, vengono utilizzati laser a impulsi a femtosecondi, con potenza istantanea che raggiunge il livello di megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza di due-fotoni è più corta di quella della luce di eccitazione, equivalente all'effetto prodotto dall'eccitazione a metà lunghezza d'onda di eccitazione.
