Come scegliere il giusto microscopio a fluorescenza
Il microscopio a fluorescenza è un'apparecchiatura di imaging microscopico standard per laboratori e reparti di patologia. Utilizza le caratteristiche di fluorescenza per l'osservazione e l'imaging. È ampiamente utilizzato in biologia cellulare, neurobiologia, botanica, microbiologia, patologia, genetica e altri campi. L'imaging a fluorescenza presenta i vantaggi dell'elevata sensibilità e dell'elevata specificità ed è molto adatto per l'osservazione della distribuzione di proteine e organelli specifici nei tessuti e nelle cellule, lo studio della colocalizzazione e dell'interazione, il monitoraggio dei processi dinamici della vita come i cambiamenti della concentrazione di ioni , eccetera.
Scelta del microscopio
I microscopi a fluorescenza si dividono principalmente in tre categorie: microscopi a fluorescenza diritti (adatti al sezionamento), microscopi a fluorescenza invertiti (adatti a cellule viventi, tenendo conto del sezionamento), microscopi a fluorescenza stereoscopici (adatti a campioni più grandi, come piante, pesci zebra (adulti/ embrione), medaka, organi di topo/ratto, ecc.).
Selezione di cubi filtro per fluorescenza
Oltre a considerare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione delle sonde fluorescenti, la selezione dei blocchi filtro deve anche considerare se esiste un'eccitazione non specifica e un colore incrociato per i campioni con etichetta multicolore. Nell'esperimento, proveremo a scegliere la lunghezza d'onda più vicina al picco di eccitazione per l'eccitazione e l'intervallo di ricezione deve includere il picco di emissione. Ad esempio, il picco di eccitazione di Alexa Fluor 488 è di 500 nm e un filtro di eccitazione 480/40 può essere selezionato in un microscopio a fluorescenza. I cubi filtro per fluorescenza comunemente usati nei microscopi a fluorescenza possono essere divisi in due tipi: passa lungo (LP in breve) e passa banda (BP in breve), anch'essi da selezionare in base alle esigenze.
Scelta della sorgente luminosa fluorescente
Le sorgenti luminose fluorescenti attualmente comunemente utilizzate includono lampade al mercurio, lampade ad alogenuri metallici e sorgenti luminose a LED che si sono sviluppate rapidamente negli ultimi anni. Lo spettro della sorgente luminosa fluorescente è continuo e discontinuo e l'energia sarà diversa nelle diverse bande. Grazie alla sua banda spettrale relativamente stretta, all'emissione di energia più stabile, alla lunga durata, alla sicurezza e alla protezione ambientale e a molti altri vantaggi, la sorgente luminosa a LED sta gradualmente diventando la principale fonte di luce del microscopio a fluorescenza.
microscopio confocale
Nell'osservazione tradizionale del microscopio a fluorescenza, a causa della sovrapposizione di sostanze marker fluorescenti e strutture di autofluorescenza, sono strettamente combinate, mentre la tradizionale lente dell'obiettivo del microscopio a epifluorescenza non solo raccoglie la luce dal piano focale, ma raccoglie anche la luce diffusa sopra e sotto il piano focale , con conseguente risoluzione e contrasto dell'immagine notevolmente ridotti.
L'imaging confocale risolve questo problema rilevando solo la porzione di luce riflessa dal piano focale. La sorgente luminosa passa attraverso un foro stenopeico per formare un punto luminoso piccolo e fine sul piano focale. La luce emessa dal piano focale viene raccolta dalla lente dell'obiettivo. La maggior parte della fluorescenza emessa dal punto sopra o sotto il piano focale della lente dell'obiettivo non può convergere verso il piccolo foro. Solo la fluorescenza situata nel piano focale e una piccola parte della fluorescenza fuori fuoco possono passare attraverso il foro stenopeico, mentre i fasci di luce al di fuori del piano focale convergono nella parte anteriore o posteriore della piastra del foro stenopeico e sono bloccati dall'entrare nel rivelatore attraverso il foro stenopeico. L'immagine rilevata è l'immagine dal piano focale, quindi la qualità dell'immagine finale è notevolmente migliorata.
Grazie ai vantaggi e alla praticabilità delle funzioni del microscopio confocale a scansione laser, il microscopio confocale è un assistente sperimentale indispensabile nel campo della biologia cellulare ad alta precisione, della botanica e della ricerca cellulare. Allo stesso tempo, nel futuro centro di ricerca scientifica, sarà lo strumento di ricerca scientifica più fondamentale e fondamentale.
