Come si osserva la morfologia delle cellule microbiche al microscopio?
I microscopi sono stati inventati per vedere oggetti sorridenti che non possono essere visti ad occhio nudo. I microrganismi sono molto piccoli, quindi devono essere ingranditi e osservati con l'aiuto di un microscopio. Inoltre, esistono molti tipi di microrganismi, quindi sostanzialmente la maggior parte dei microscopi ottici può osservare i microrganismi. La domanda successiva è quale tipo di microscopio dovrebbe essere utilizzato per l'osservazione e l'analisi di quale tipo di microrganismi. I microscopi comuni che possono essere utilizzati per osservare la morfologia microbica includono microscopi biologici, microscopi a contrasto di fase, microscopi invertiti, microscopi a fluorescenza, microscopi confocali, ecc.
Di seguito vengono descritti i vari microscopi utilizzati per osservare i microrganismi:
1. Il microscopio ottico ordinario utilizza la luce naturale o la luce come sorgente luminosa e la sua lunghezza d'onda è di circa 0,4 μm. La risoluzione del microscopio è la metà della lunghezza d'onda, ovvero 0,2 μm, e l'immagine più piccola visibile ad occhio nudo è 0,2 mm. Pertanto, utilizzando uno specchio a olio (a immersione) per ingrandire 1000 volte è possibile ingrandire le particelle da 0,2 μm in 0,2 mm visibili a occhio nudo. I normali microscopi ottici possono essere utilizzati per l'osservazione di batteri, attinomiceti e funghi.
2. La microscopia in campo oscuro viene comunemente utilizzata per osservare la morfologia e il movimento microbico non colorato. Dopo aver installato il condensatore per campo scuro nel normale microscopio, la luce non può penetrare direttamente dal centro e il campo visivo è scuro. Quando il campione riceve luce obliqua dal bordo del condensatore, può essere disperso, quindi si possono osservare microrganismi luminosi come batteri o spirochete sullo sfondo del campo scuro.
3. Microscopio a contrasto di fase Il microscopio a contrasto di fase utilizza l'effetto luminoso della piastra con differenza di fase per modificare la fase luminosa e l'ampiezza della luce diretta e convertire la differenza di fase luminosa in differenza di intensità luminosa. Al microscopio a contrasto di fase, quando la luce passa attraverso un campione non colorato, la differenza nella fase della luce è causata dall'incoerenza della densità delle diverse parti del campione e si possono osservare la morfologia, la struttura interna e la modalità di movimento dei microrganismi.
4. Microscopio a fluorescenza Il microscopio a fluorescenza è fondamentalmente uguale al normale microscopio ottico, la differenza principale è la sorgente luminosa, il filtro e il condensatore. Attualmente, la maggior parte di essi utilizza dispositivi epi-light e come sorgenti luminose vengono comunemente utilizzate lampade al mercurio ad alta pressione, che possono emettere luce ultravioletta o blu-viola. Esistono due tipi di filtri: filtro di eccitazione e filtro di assorbimento. Oltre ai condensatori generali per campo chiaro, i condensatori per campo scuro possono essere utilizzati anche nei microscopi a fluorescenza che utilizzano la luce blu per migliorare il contrasto tra fluorescenza e sfondo. Questo metodo è applicabile al rilevamento o all'identificazione di batteri colorati con pigmenti fluorescenti o combinati con anticorpi fluorescenti.
5. I microscopi elettronici utilizzano il flusso di elettroni come sorgente luminosa e la lunghezza d'onda è decine di migliaia di volte diversa dalla luce visibile, il che migliora notevolmente la risoluzione. Utilizza anche una bobina magnetica come sistema di amplificazione ottica e l'ingrandimento può raggiungere decine di migliaia o centinaia di migliaia di volte. Viene spesso utilizzato per l'osservazione di particelle virali e ultrastruttura batterica.
Osservazione di campioni microbici non colorati:
I campioni non colorati possono generalmente essere utilizzati per osservare la morfologia, la potenza e il movimento dei batteri. I batteri sono incolori e trasparenti quando non colorati e si osservano al microscopio principalmente dalla differenza tra l'indice di rifrazione dei batteri e l'ambiente circostante. I batteri dotati di flagelli si muovono vigorosamente, mentre i batteri senza flagelli mostrano un movimento browniano irregolare. Batteri vitali come Treponema pallidum, Leptospira e Campylobacter hanno forme e schemi di movimento distintivi, che hanno significato diagnostico. I metodi comunemente utilizzati sono il metodo della caduta di pressione, il metodo della caduta pendente e il metodo capillare.
1. Applicare vaselina attorno al foro concavo del vetro concavo pulito utilizzando il metodo delle gocce sospese, utilizzare un'ansa per inoculazione per prendere un anello di sospensione batterica e posizionarlo al centro del vetro di copertura, quindi allineare il foro concavo del vetro concavo con goccia al centro del vetro di copertura e coprirlo, quindi capovolgerlo rapidamente, premere leggermente il vetro di copertura per farlo aderire saldamente alla vaselina sul bordo del foro concavo e osservare con un microscopio ad alto ingrandimento (o campo scuro).
2. Prendere un anello di sospensione batterica con un'ansa di inoculazione e posizionarlo al centro di un vetrino pulito mediante il metodo della caduta di pressione, quindi coprire delicatamente la sospensione batterica con un vetrino coprioggetto, facendo attenzione a evitare bolle e traboccamento della sospensione batterica. . Dopo essere rimasti fermi per alcuni secondi, osservare al microscopio ad alta potenza in campo chiaro (o campo scuro).
3. Il metodo capillare viene utilizzato principalmente per l'esame della cinetica dei batteri anaerobici. Di solito scegli una lunghezza di 60~70mm. Dopo aver travasato la sospensione di batteri anaerobici attraverso un capillare con un'apertura di 0,5-1,0 mm, sigillare le due estremità del capillare con una fiamma. Il capillare è stato fissato sul vetrino con carta di plastica e osservato sotto una lente ad alto ingrandimento in campo scuro.
Osservazione di campioni microbici colorati al microscopio:
Dopo che il campione batterico è stato colorato, a causa del netto contrasto di colore tra i batteri e l'ambiente circostante, le caratteristiche morfologiche dei batteri (come dimensione, forma, disposizione, ecc.) dei batteri e alcune strutture speciali (come (come capsule, flagelli, spore, ecc.) possono essere chiaramente osservati al microscopio ottico comune, ed i batteri possono essere classificati e identificati in base alla reattività alla colorazione.
(1) Procedura generale della colorazione batterica La procedura generale della colorazione batterica è: striscio (asciugatura)—fissazione—colorazione.
1. Preparazione di strisci di sangue, secrezioni, escrezioni, liquido di puntura e coltura liquida e strisci diretti con pellicola sottile su vetrini; autopsia o tessuti animali infetti, spalmare la lesione con un tampone di cotone per il campionamento. Per la preparazione di colonie batteriche o colonie batteriche su terreno solido, utilizzare innanzitutto un'ansa di inoculazione per prelevare un anello di soluzione salina normale e metterlo al centro del vetrino, quindi utilizzare un'ansa di inoculazione sterile per prelevare una piccola quantità di coltura e macinarla distribuirlo uniformemente in soluzione salina normale, stenderlo su una superficie rivestita di 1 cm2 e lasciarlo asciugare naturalmente a temperatura ambiente o asciugare lentamente a distanza.
2. Lo scopo della fissazione è uccidere i batteri, coagulare le proteine e la struttura batterica e facilitare la colorazione; favorire l'adesione dei batteri al vetrino per evitare di essere lavati via dall'acqua durante il lavaggio; modificare la permeabilità dei batteri ai coloranti, il che è benefico per la colorazione delle strutture intracellulari batteriche. Di solito viene fissato riscaldando con una fiamma e lo striscio essiccato viene fatto passare rapidamente attraverso la fiamma per 3 volte. È meglio non bruciare la pelle del dorso della mano quando si tocca il vetrino.
3. Tintura In base ai diversi scopi di ispezione, scegliere diversi metodi di tintura per la tintura. Durante la tintura, aggiungere goccia a goccia la soluzione colorante per aumentare la coprenza.
4. Mordente Qualsiasi sostanza in grado di migliorare l'affinità tra il colorante e l'oggetto tinto, fissare il colorante sull'oggetto tinto e causare un cambiamento nella permeabilità della membrana cellulare è chiamata mordente. Comunemente usati sono allume, acido tannico, sali metallici e iodio, ecc., E il riscaldamento viene utilizzato anche per favorire la colorazione. I mordenti possono essere utilizzati tra la colorazione primaria e la controcolorazione e possono essere utilizzati anche dopo la fissazione o contenuti nel fissativo e nella colorazione.
5. Decolorazione Qualsiasi agente chimico in grado di rimuovere il colore dell'oggetto tinto è chiamato decolorante. Etanolo, acetone, ecc. Sono comunemente usati come decoloranti. L'agente decolorante può rilevare il grado di stabilità della combinazione di batteri e coloranti, che può essere utilizzato per la colorazione differenziale.
6. Controcolorazione I batteri o le loro strutture che sono state decolorate vengono spesso controcolorati con una soluzione di controcolorazione per una facile osservazione. Il colore della soluzione di controcolorazione è diverso da quello della soluzione colorante primaria per formare un netto contrasto. La controcolorazione non deve essere troppo forte, per non coprire il colore della colorazione iniziale.
