In che modo la microscopia a fluorescenza differisce dalla microscopia convenzionale
Recentemente ho provato a realizzare alcune sezioni congelate di topi e ora devo usare un microscopio a fluorescenza per vedere se il virus che ho iniettato si trova nell'area del cervello desiderata. Alcuni principi di base della microscopia a fluorescenza necessitano di essere studiati brevemente e li condividerò anche qui.
Il microscopio a fluorescenza utilizza la luce ultravioletta come sorgente luminosa per illuminare l'oggetto da testare, facendo sì che l'oggetto emetta una sorgente luminosa e quindi osservando l'oggetto al microscopio. Utilizzato principalmente per le cellule di immunofluorescenza, è composto da una sorgente luminosa, un sistema di piastre filtranti e un sistema ottico per osservare l'immagine fluorescente del campione attraverso l'ingrandimento dell'oculare e della lente dell'obiettivo. Diamo un'occhiata alla differenza tra questo microscopio a fluorescenza e un normale microscopio ottico.
1. In termini di metodi di illuminazione
Il metodo di illuminazione di un microscopio a fluorescenza utilizza generalmente un metodo a fascio cadente, il che significa che la sorgente luminosa viene proiettata sul campione di prova attraverso la lente dell'obiettivo.
2. In termini di risoluzione
La microscopia a fluorescenza utilizza la luce ultravioletta come sorgente luminosa, con una lunghezza d'onda relativamente corta ma una risoluzione più elevata rispetto ai normali microscopi ottici.
3. Differenze sul filtro
Un microscopio a fluorescenza utilizza due filtri speciali, uno davanti alla sorgente luminosa per filtrare la luce visibile e l'altro tra l'obiettivo e l'oculare per filtrare la luce ultravioletta, che può proteggere gli occhi.
La microscopia a fluorescenza è anche un tipo di microscopio ottico, principalmente perché la lunghezza d'onda eccitata dalla microscopia a fluorescenza è breve, il che porta a differenze nella struttura e nell'uso della microscopia a fluorescenza e della microscopia ordinaria. La maggior parte dei microscopi a fluorescenza hanno una buona funzione di catturare la luce debole, quindi la loro capacità di imaging è buona anche in condizioni di fluorescenza estremamente debole. Inoltre, con il continuo miglioramento della microscopia a fluorescenza negli ultimi anni, anche il rumore è stato notevolmente ridotto. Pertanto vengono utilizzati sempre più microscopi a fluorescenza.
Conoscenze relative alla microscopia a fluorescenza a due fotoni
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è che ad alta densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire simultaneamente due fotoni a lunga lunghezza d'onda e, dopo un breve periodo della cosiddetta durata dello stato eccitato, emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta; Il suo effetto è lo stesso che si ottiene utilizzando un fotone con una lunghezza d'onda pari alla metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare le molecole fluorescenti. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni e, per evitare di danneggiare le cellule, in un microscopio a due fotoni viene utilizzato un laser a impulsi con modalità bloccata ad alta energia. Il laser emesso da questo tipo di laser ha un'energia di picco elevata e un'energia media bassa, con una larghezza di impulso di soli 100 femtosecondi e una frequenza fino a 80-100 megahertz. Quando si utilizza un obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni di un laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione a due fotoni avviene solo nel punto focale dell'obiettivo. Pertanto, un microscopio a due fotoni non richiede fori stenopeici confocali, il che migliora l'efficienza del rilevamento della fluorescenza.
Nei fenomeni di fluorescenza generali, a causa della bassa densità di fotoni di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone allo stesso tempo e quindi emettere un fotone fluorescente attraverso la transizione della radiazione, che è chiamata fluorescenza a fotone singolo. Nel processo di eccitazione della fluorescenza che utilizza il laser come sorgente luminosa possono verificarsi fenomeni di fluorescenza a due fotoni o addirittura multifotoni. In questo momento, la sorgente luminosa di eccitazione utilizzata è ad alta intensità e la densità dei fotoni soddisfa il requisito per le molecole fluorescenti di assorbire due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo di un tipico laser come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni non è ancora sufficiente a generare il fenomeno di assorbimento di due fotoni. Tipicamente, vengono utilizzati laser a impulsi a femtosecondi e la loro potenza istantanea può raggiungere il livello di megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è inferiore a quella dell'eccitazione, il che equivale all'effetto prodotto dall'eccitazione della lunghezza d'onda di mezza eccitazione.
