Conoscenze relative al microscopio a fluorescenza
Il principio di base della microscopia a fluorescenza confocale: una sorgente luminosa puntiforme viene utilizzata per irradiare il campione e sul piano focale si forma un piccolo punto luminoso ben definito. composto da divisori. Il divisore di fascio invia la fluorescenza direttamente al rivelatore. C'è un foro stenopeico davanti alla sorgente luminosa e al rilevatore, rispettivamente chiamato foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevamento. La dimensione geometrica dei due è la stessa, circa 100-200nm; rispetto al punto luminoso sul piano focale, i due sono coniugati, cioè il punto luminoso passa attraverso una serie di lenti, e infine può essere focalizzato contemporaneamente sul foro stenopeico di illuminazione e sul foro stenopeico di rilevamento. In questo modo, la luce proveniente dal piano focale può convergere all'interno dell'ambito del foro di rilevamento, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata all'esterno del foro di rilevamento e non può essere ripresa. Il laser scansiona punto per punto il campione, e il tubo fotomoltiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene punto per punto anche l'immagine confocale del corrispondente punto luce, che viene convertita in segnale digitale e trasmessa al computer, ed infine aggregata in un chiaro immagine confocale dell'intero piano focale sullo schermo.
Ogni immagine del piano focale è in realtà una sezione ottica del campione, e questa sezione ottica ha sempre un certo spessore, noto anche come sezione ottica sottile. Poiché l'intensità della luce nel punto focale è molto maggiore di quella nel punto non focale e la luce del piano non focale è filtrata dal foro stenopeico, la profondità di campo del sistema confocale è approssimativamente zero e la scansione lungo la Z -axis può realizzare la tomografia ottica, formando un Osservare la sezione ottica bidimensionale nel punto focalizzato del campione. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), l'immagine tridimensionale del campione può essere ottenuta accumulando immagini bidimensionali di strati continui ed elaborata da uno speciale software per computer.
Cioè, il foro stenopeico di rilevamento e il foro stenopeico della sorgente luminosa sono sempre focalizzati sullo stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata al di fuori del piano focale non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
La semplice espressione del principio di funzionamento del laser confocale è che utilizza la luce laser come sorgente luminosa. Sulla base dell'imaging tradizionale del microscopio a fluorescenza, aggiunge un dispositivo di scansione laser e un dispositivo di messa a fuoco coniugato, ed è un sistema per l'acquisizione e l'elaborazione di immagini digitali attraverso il controllo del computer.
