Caratteristiche e confronto tra il microscopio a fluorescenza e il microscopio ottico convenzionale
Un microscopio a fluorescenza differisce da un normale microscopio ottico. Invece di illuminare il campione con sorgenti luminose ordinarie, utilizza la luce di una lunghezza d'onda specifica (solitamente luce ultravioletta o blu-viola) per eccitare le sostanze fluorescenti all'interno del campione affinché emettano fluorescenza. La luce proveniente dalla sorgente luminosa non viene utilizzata per l'illuminazione diretta, ma serve come energia di eccitazione per le sostanze fluorescenti nel campione. Pertanto, possiamo osservare il campione non grazie all'illuminazione proveniente dalla sorgente luminosa, ma a causa della fluorescenza emessa dopo che le sostanze fluorescenti nel campione assorbono la luce di eccitazione. Ne consegue che la caratteristica fondamentale di un microscopio a fluorescenza è che la sua sorgente luminosa deve fornire luce di eccitazione di una lunghezza d'onda specifica, che consente alle sostanze fluorescenti nel campione di emettere fluorescenza di intensità sufficiente. Nel frattempo, un microscopio a fluorescenza deve essere dotato di un sistema di filtri dedicato. Il microscopio a fluorescenza è uno strumento fondamentale per l'istochimica dell'immunofluorescenza. È costituito principalmente da una sorgente luminosa ad altissima pressione, set di filtri (compresi filtri di eccitazione e barriera), un sistema ottico e componenti di supporto. Utilizza la luce di una lunghezza d'onda specifica per eccitare i fluorofori.
Esistono due modalità di eccitazione classificate in base alla gamma di lunghezze d'onda: il metodo di eccitazione UV (metodo di irradiazione ultravioletta) e il metodo di eccitazione BV (metodo di eccitazione blu-viola).
Metodo di eccitazione UV: per l'eccitazione viene utilizzata la luce quasi ultravioletta inferiore a 400 nm. In questo metodo non esiste alcuna luce di eccitazione visibile. La fluorescenza osservata mostra la fluorescenza intrinseca del colorante, rendendo facile distinguere la fluorescenza specifica sul campione dall'autofluorescenza del tessuto di fondo.
Metodo di eccitazione BV: l'eccitazione viene eseguita con luce centrata a 404 nm e 434 nm, che va dall'ultravioletto al blu-viola. Con questo metodo la luce blu irradia il campione. Pertanto, il filtro barriera del sistema di osservazione della fluorescenza deve bloccare completamente la luce blu trasmettendo al tempo stesso la necessaria fluorescenza verde e gialla. Viene utilizzato per i fluorocromi nei test di immunofluorescenza. Poiché la lunghezza d'onda di assorbimento massima del fluorocromo è vicina alla lunghezza d'onda di eccitazione del metodo BV, la luce blu può essere utilizzata come luce di eccitazione, ottenendo un'elevata efficienza di assorbimento della luce del fluorocromo e immagini relativamente chiare. Lo svantaggio è che non è possibile osservare la fluorescenza a lunghezze d'onda inferiori a 500 nm e sull'immagine possono essere visualizzati solo segnali di fluorescenza superiori a 500 nm. Nei test di immunofluorescenza, i fluorocromi sono identificati in parte dal loro colore. Pertanto, quando si discute della specificità sottile, lo svantaggio sopra menzionato del metodo di eccitazione BV ha un impatto significativo.
