Migliorare i vantaggi della microscopia a scansione laser multifotone
La microscopia multifotone a scansione laser rappresenta un importante miglioramento rispetto alla microscopia ottica. Può osservare la struttura profonda di cellule viventi, cellule fisse e tessuti e può ottenere strutture Z-plane multistrato chiare e nitide, ovvero sezioni ottiche, da cui può costruire la struttura solida tridimensionale del campione. La microscopia confocale utilizza una sorgente di luce laser che, dopo l'espansione, riempie l'intero piano focale posteriore della lente dell'obiettivo e quindi passa attraverso il sistema di lenti della lente dell'obiettivo per convergere in un punto molto piccolo sul piano focale del campione. A seconda dell'apertura numerica della lente dell'obiettivo, il diametro del punto di illuminazione più luminoso è di circa 0,25 ~ 0,8μm e la profondità è di circa 0,5 ~ 1,5μm . La dimensione dello spot confocale dipende dal design del microscopio, dalla lunghezza d'onda del laser, dalle caratteristiche della lente dell'obiettivo, dalle impostazioni dello stato dell'unità di scansione e dalle proprietà del campione. Il campo di illuminazione e la profondità di illuminazione di un microscopio da campo sono ampi, mentre l'illuminazione di un microscopio confocale è concentrata su un fuoco preciso sul piano focale. Il vantaggio più fondamentale della microscopia confocale è che può eseguire il sezionamento ottico fine di campioni fluorescenti spessi (che possono raggiungere 50 μm o più) e lo spessore delle fette è compreso tra circa 0,5 e 1,5 μm. Le immagini della sezione ottica seriale possono essere ottenute spostando il campione su e giù utilizzando un sofisticato motore passo-passo sull'asse Z del microscopio. La raccolta delle informazioni sull'immagine è controllata su un piano preciso senza essere interferita da segnali emessi da altre posizioni sul campione. Dopo aver rimosso l'influenza della fluorescenza di fondo e aumentato il rapporto segnale-rumore, il contrasto e la risoluzione delle immagini confocali risultano significativamente migliorati rispetto alle tradizionali immagini a fluorescenza illuminate sul campo. In molti esemplari, molti componenti strutturali intricati sono intrecciati per formare sistemi complessi, ma una volta raccolte abbastanza sezioni ottiche, possiamo ricostruirle in tre dimensioni tramite il software. Questo metodo sperimentale è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biologica per chiarire le complesse relazioni strutturali e funzionali tra cellule o tessuti.
