Conta diretta dei microrganismi al microscopio
Principio sperimentale
Il conteggio diretto al microscopio utilizzando un emocitometro è un metodo di conteggio microbico comunemente utilizzato. Il vantaggio di questo metodo è che è intuitivo e veloce. Posizionare la sospensione batterica (o sospensione di spore) opportunamente diluita nella camera di conteggio tra il vetrino e il vetro di copertura dell'emocitometro e contare al microscopio. Poiché il volume della camera di conteggio è fisso (0,1 mm2), può essere convertito nel numero totale di microrganismi per unità di volume in base al numero di microrganismi osservati al microscopio. Poiché questo metodo conta la somma dei batteri vivi e morti, è anche chiamato metodo di conteggio totale dei batteri.
Un emocitometro è solitamente uno speciale vetrino su cui quattro scanalature formano tre piattaforme. La piattaforma al centro è divisa in due metà da una breve scanalatura orizzontale. Una griglia è incisa sulla piattaforma su ciascun lato. Ogni griglia è divisa in nove grandi quadrati. La grande piazza al centro è la sala di conteggio. I microrganismi vengono contati nella camera di conteggio. La struttura della scheda per il conteggio delle cellule del sangue è mostrata nella Figura Ⅷ-1.
La scala della stanza di conteggio ha generalmente due specifiche, una è che un quadrato grande è diviso in 16 quadrati medi, e ogni quadrato centrale è diviso in 25 quadrati piccoli (Figura Ⅷ-2); l'altro è una grande piazza. Il quadrato è diviso in 25 quadrati centrali e ogni quadrato centrale è diviso in 16 quadrati piccoli (Figura Ⅷ-1, C). Ma non importa che tipo di tabellone di conteggio sia, il numero di quadrati piccoli in ogni quadrato grande è lo stesso, cioè 16×25=400 quadrati piccoli, come mostrato nella Figura Ⅷ-2.
La lunghezza del lato di ciascun quadrato grande è 1 mm e l'area di ciascun quadrato grande è 1 mm2. Dopo aver coperto il vetro di copertura, l'altezza tra il vetrino e il vetro di copertura è 0,1 mm, quindi il volume della camera di conteggio è 0,1 mm3.
Durante il conteggio, di solito si conta il numero totale di batteri nelle cinque griglie centrali, quindi si ottiene il valore medio di ciascuna griglia centrale, quindi si moltiplica per 16 o 25 per ottenere il numero totale di batteri in una griglia grande, quindi si converte in numero totale di batteri in 1 ml di soluzione batterica.
Attrezzatura da laboratorio
Emocitometro, microscopio, coprioggetto, capillare sterile;
Materiali sperimentali
Sospensione di Saccharomyces cerevisiae
Procedura sperimentale (metodo di conteggio diretto al microscopio microbico)
1. diluizione
Diluire adeguatamente la sospensione di Saccharomyces cerevisiae. Se la soluzione batterica non è densa, non è necessario diluirla.
2. Sala di conteggio microscopica
Prima di aggiungere i campioni, eseguire un'ispezione al microscopio della camera di conteggio della piastra di conteggio. Se è presente dello sporco, è necessario pulirlo prima del conteggio.
3. aggiungere il campione
Coprire la piastra dell'emocitometro pulita e asciutta con un vetro di copertura, quindi utilizzare un contagocce sterile a bocca sottile per far cadere una piccola goccia della soluzione diluita di Saccharomyces cerevisiae dal bordo del vetro di copertura (non troppo), in modo che la soluzione batterica è vicino al divario lungo il divario. L'osmosi capillare entra da sola nella camera di conteggio e la camera di conteggio generale può essere riempita con liquido batterico. Fare attenzione a non formare bolle d'aria.
4. conteggio al microscopio
Dopo aver riposato per 5 minuti, posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio, utilizzare prima una lente a basso ingrandimento per trovare la posizione della camera di conteggio, quindi passare a una lente ad alto ingrandimento per il conteggio. Se si riscontra che la soluzione batterica è troppo densa o troppo liquida prima del conteggio, è necessario regolare nuovamente la diluizione prima del conteggio. Generalmente, la diluizione del campione richiede circa 5-10 batteri in ciascuna cellula. Ciascuna camera di conteggio seleziona i batteri in 5 griglie centrali (4 angoli e griglie centrali opzionali) per il conteggio. I batteri sulla linea della griglia vengono generalmente contati solo sulle linee superiore e destra. In caso di gemmazione del lievito, quando la dimensione del corpo della gemma raggiunge la metà della cellula madre, contare due batteri. Contare un campione per calcolare il contenuto batterico del campione dai valori contati nelle due camere di conteggio.
5. Pulizia dell'emocitometro
Dopo l'uso, sciacquare la piastra per il conteggio delle cellule del sangue sul rubinetto con getti d'acqua, non lavarla con oggetti duri e asciugarla da soli o con un asciugacapelli dopo il lavaggio. Esame microscopico, osservare se sono presenti batteri residui o altri sedimenti in ciascuna cellula. Se non è pulito, deve essere lavato ripetutamente fino a quando non sarà pulito.
