Differenza tra microscopio ordinario e microscopio a fluorescenza
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa per irradiare l'oggetto da ispezionare, in modo che l'oggetto emetta luce e quindi osservare l'oggetto al microscopio. Viene utilizzato principalmente per le cellule di immunofluorescenza. È composto principalmente da una sorgente luminosa, un sistema di piastre filtranti e un sistema ottico per osservare l'immagine fluorescente del campione attraverso l'ingrandimento dell'oculare e della lente dell'obiettivo. Diamo un'occhiata alla differenza tra questo microscopio a fluorescenza e un normale microscopio ottico.
1. In termini di metodi di illuminazione
Il metodo di illuminazione del microscopio a fluorescenza è generalmente episcopico, vale a dire che la sorgente luminosa viene proiettata sul campione in esame attraverso la lente dell'obiettivo.
2. In termini di risoluzione
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa. La lunghezza d'onda è relativamente breve, ma la risoluzione è superiore a quella dei normali microscopi ottici.
3. La differenza nel filtro
Il microscopio a fluorescenza utilizza due filtri speciali, che vengono utilizzati davanti alla sorgente luminosa per filtrare la luce visibile e utilizzati tra la lente dell'obiettivo e l'oculare per filtrare la luce ultravioletta, che può proteggere gli occhi umani.
Il microscopio a fluorescenza è anche una specie di microscopio ottico, principalmente perché la lunghezza d'onda eccitata dal microscopio a fluorescenza è breve, quindi questo porta alla differenza nella struttura e nell'uso tra microscopio a fluorescenza e microscopio ordinario. La maggior parte dei microscopi a fluorescenza ha una buona funzione di catturare la luce debole, quindi in condizioni di fluorescenza estremamente debole, anche la sua capacità di imaging è buona. Insieme al continuo miglioramento dei microscopi a fluorescenza negli ultimi anni, anche il rumore è stato notevolmente ridotto. Pertanto vengono utilizzati sempre più microscopi a fluorescenza.
Conoscenza della microscopia a fluorescenza a due fotoni
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è: nel caso di un'elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire due fotoni a lunghezza d'onda lunga contemporaneamente ed emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta dopo un breve periodo della cosiddetta durata dello stato eccitato . ; l'effetto è lo stesso dell'utilizzo di un fotone la cui lunghezza d'onda è metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare una molecola fluorescente. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni. Per non danneggiare le cellule, la microscopia a due fotoni utilizza laser pulsati bloccati in modalità ad alta energia. Il laser emesso da questo laser ha un'energia di picco elevata e un'energia media bassa, la sua larghezza di impulso è di soli 100 femtosecondi e la sua frequenza può raggiungere da 80 a 100 megahertz. Quando si utilizza una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni del laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione a due fotoni si verifica solo nel punto focale della lente dell'obiettivo, quindi il microscopio a due fotoni non necessita di un foro stenopeico confocale, il che migliora l'efficienza di rilevamento della fluorescenza.
Nei fenomeni generali di fluorescenza, a causa della bassa densità di fotoni della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone alla volta e quindi emettere un fotone fluorescente attraverso una transizione radiativa, che è la fluorescenza a singolo fotone. Per il processo di eccitazione della fluorescenza che utilizza il laser come sorgente luminosa, può verificarsi una fluorescenza a due fotoni o anche a più fotoni. In questo momento, l'intensità della sorgente luminosa di eccitazione utilizzata è elevata e la densità dei fotoni soddisfa i requisiti delle molecole fluorescenti che assorbono due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo di un laser generale come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni non è ancora sufficiente per produrre il fenomeno dell'assorbimento a due fotoni. Di solito viene utilizzato un laser pulsato a femtosecondi e la sua potenza istantanea può raggiungere l'ordine dei megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è più corta della lunghezza d'onda della luce di eccitazione, che è equivalente all'effetto prodotto dall'eccitazione a metà della lunghezza d'onda di eccitazione.
La microscopia a fluorescenza a due fotoni presenta molti vantaggi:
1) La luce a lunghezza d'onda lunga è meno influenzata dalla diffusione rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta e penetra facilmente nel campione;
2) Le molecole fluorescenti al di fuori del piano focale non sono eccitate, in modo che più luce di eccitazione possa raggiungere il piano focale, in modo che la luce di eccitazione possa penetrare campioni più profondi;
3) La luce nel vicino infrarosso a lunghezza d'onda lunga è meno tossica per le cellule rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta;
4) Quando si utilizza un microscopio a due fotoni per osservare i campioni, il fotosbiancamento e la fototossicità si verificano solo nel piano focale. Pertanto, la microscopia a due fotoni è più adatta della microscopia a singolo fotone per l'osservazione di campioni spessi, per l'osservazione di cellule viventi o per esperimenti di fotosbiancamento spot.
Conoscenza della microscopia confocale a fluorescenza
Il principio di base della microscopia a fluorescenza confocale: una sorgente luminosa puntiforme viene utilizzata per irradiare il campione e sul piano focale si forma un piccolo punto luminoso ben definito. composto da divisori. Il divisore di fascio invia la fluorescenza direttamente al rivelatore. C'è un foro stenopeico davanti alla sorgente luminosa e al rilevatore, rispettivamente chiamato foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevamento. La dimensione geometrica dei due è la stessa, circa 100-200nm; rispetto al punto luminoso sul piano focale, i due sono coniugati, cioè il punto luminoso passa attraverso una serie di lenti, e infine può essere focalizzato contemporaneamente sul foro stenopeico di illuminazione e sul foro stenopeico di rilevamento. In questo modo, la luce proveniente dal piano focale può convergere all'interno dell'ambito del foro di rilevamento, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata all'esterno del foro di rilevamento e non può essere ripresa. Il laser scansiona punto per punto il campione, e il tubo fotomoltiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene punto per punto anche l'immagine confocale del corrispondente punto luce, che viene convertita in segnale digitale e trasmessa al computer, ed infine aggregata in un chiaro immagine confocale dell'intero piano focale sullo schermo.
Ogni immagine sul piano focale è in realtà una sezione ottica del campione. Questa sezione ottica ha sempre un certo spessore, noto anche come sezione sottile ottica. Poiché l'intensità della luce nel punto focale è molto maggiore di quella nel punto non focale e la luce del piano non focale è filtrata dal foro stenopeico, la profondità di campo del sistema confocale è approssimativamente zero e la scansione lungo la Z -axis può realizzare la tomografia ottica, formando un Osservare la sezione ottica bidimensionale nel punto focalizzato del campione. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), l'immagine tridimensionale del campione può essere ottenuta accumulando immagini bidimensionali di strati continui ed elaborata da uno speciale software per computer.
Cioè, il foro stenopeico di rilevamento e il foro stenopeico della sorgente luminosa sono sempre focalizzati sullo stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata al di fuori del piano focale non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
La semplice espressione del principio di funzionamento del laser confocale è che utilizza il laser come sorgente di luce e, sulla base dell'imaging tradizionale del microscopio a fluorescenza, aggiunge un dispositivo di scansione laser e un dispositivo di messa a fuoco coniugato ed è un sistema per l'acquisizione di immagini digitali e trattamento tramite controllo informatico.
