Confronto e caratteristiche dei microscopi a fluorescenza e dei microscopi ottici convenzionali
Un microscopio a fluorescenza differisce da un normale microscopio ottico. Invece di osservare i campioni sotto l'illuminazione di una sorgente luminosa convenzionale, utilizza la luce di una lunghezza d'onda specifica (solitamente luce ultravioletta o blu-viola) per eccitare le sostanze fluorescenti all'interno del campione, facendole emettere fluorescenza. Pertanto la sorgente luminosa di un microscopio a fluorescenza non serve per l'illuminazione diretta; funge da fonte di energia per eccitare le sostanze fluorescenti endogene presenti nel campione. Siamo in grado di osservare il campione non grazie all'illuminazione proveniente dalla sorgente, ma grazie alla fluorescenza emessa dalle sostanze fluorescenti nel campione dopo aver assorbito la luce di eccitazione.
Ne consegue che la caratteristica fondamentale di un microscopio a fluorescenza è la sua sorgente luminosa, che può fornire abbondante luce di eccitazione all'interno di uno specifico intervallo di lunghezze d'onda per fornire un'intensità di eccitazione sufficiente per le sostanze fluorescenti nel campione da testare. Nel frattempo, un microscopio a fluorescenza deve essere dotato di un corrispondente sistema di filtri. Essendo uno strumento essenziale per l'istochimica della fluorescenza, è costituito principalmente da una sorgente luminosa ad altissima pressione, un set di filtri (compresi filtri di eccitazione e filtri barriera), un sistema ottico e un sistema fotografico. Funziona eccitando i campioni con luce di una certa lunghezza d'onda per produrre fluorescenza.
Metodi di eccitazione della fluorescenza: classificati in base all'intervallo di lunghezze d'onda in eccitazione UV (metodo di illuminazione ultravioletta) ed eccitazione BV (metodo della luce blu-viola). L'eccitazione UV utilizza la luce quasi ultravioletta inferiore a 400 nm per l'eccitazione. Non è coinvolta alcuna luce di eccitazione visibile, quindi la fluorescenza osservata mostra la fluorescenza intrinseca del colorante. Ciò rende facile distinguere la fluorescenza specifica sul campione dall'autofluorescenza del tessuto di fondo.
Metodo di eccitazione BV: L'eccitazione viene effettuata con luce che va dall'ultravioletto alla luce blu, centrata a 404 nm e 434 nm. Poiché con questo metodo la luce blu irradia il campione, il filtro cut-off del sistema di osservazione della fluorescenza deve bloccare completamente la luce blu trasmettendo al tempo stesso la fluorescenza verde e gialla richiesta. Questo metodo viene applicato ai fluorocromi utilizzati nelle tecniche con anticorpi fluorescenti. La lunghezza d'onda massima di assorbimento della luce di eccitazione e la lunghezza d'onda massima di emissione della fluorescenza sono relativamente vicine, quindi sono necessari filtri netti per l'eccitazione BV. Qui viene utilizzata la luce blu come luce di eccitazione, che offre un'elevata efficienza di assorbimento dei fluorocromi e produce immagini più luminose. Lo svantaggio è che la fluorescenza inferiore a 500 nm non può essere rilevata e i segnali superiori a 500 nm conferiscono all'intera immagine una tinta gialla. Nei test sugli anticorpi fluorescenti, la specificità è principalmente giudicata dal colore caratteristico del fluorocromo. Pertanto, quando si valuta la specificità sottile, lo svantaggio sopra menzionato del metodo di eccitazione BV può avere un impatto significativo.
