Classificazione e funzionamento dei microscopi per la ricerca cellulare
Il microscopio è lo strumento principale per osservare le cellule. In base alle diverse sorgenti luminose, può essere suddiviso in due categorie: microscopi ottici e microscopi elettronici. Il primo utilizza la luce visibile (i microscopi UV utilizzano la luce ultravioletta) come sorgente luminosa, mentre il secondo utilizza fasci di elettroni come sorgente luminosa.
-,Microscopio ottico
(1) Microscopio ottico ordinario
I microscopi biologici ordinari sono composti da tre parti, vale a dire: ① sistema di illuminazione, compresa la sorgente luminosa e il condensatore; ② sistema di ingrandimento ottico, composto da obiettivo e oculare, che è il corpo principale del microscopio. Per eliminare l'aberrazione sferica e l'aberrazione cromatica, sia l'oculare che l'obiettivo ③Dispositivo meccanico, utilizzato per fissare il materiale e facilitare l'osservazione (Figura 2-1).
La nitidezza dell'immagine del microscopio non è solo determinata dall'ingrandimento, ma anche dalla risoluzione del microscopio. La risoluzione si riferisce alla capacità del microscopio (o dell'occhio umano di essere a 25 cm di distanza dal bersaglio) di distinguere la minima distanza tra gli oggetti. La dimensione della risoluzione è determinata da La lunghezza d'onda e il rapporto di apertura della luce e l'indice di rifrazione del mezzo sono espressi dalla formula:
Nella formula: n=indice di rifrazione del mezzo;=angolo di apertura (l'angolo di apertura del campione rispetto all'apertura dell'obiettivo), NA=apertura dell'obiettivo (apertura numerica). L'angolo dell'obiettivo è sempre inferiore a 180 gradi, quindi il valore massimo di sina/2 deve essere inferiore a 1.
L'indice di rifrazione del vetro utilizzato per realizzare la lente ottica è compreso tra 1,65 e 1,78 e l'indice di rifrazione del mezzo utilizzato è più vicino al vetro, meglio è. Per gli obiettivi a secco, il mezzo è l'aria e il rapporto di apertura dell'obiettivo è generalmente 0.0da 5 a 0,95; per le lenti a olio, l'olio di cedro viene utilizzato come mezzo e il rapporto di apertura dell'obiettivo può essere vicino a 1,5.
La lunghezza d'onda della luce ordinaria è {{0}}nm, quindi il valore di risoluzione del microscopio non sarà inferiore a 0.2μm e la risoluzione dell'occhio umano è 0,2 mm, quindi il l'ingrandimento massimo del design generale del microscopio è solitamente 1000X.
(2) Microscopia a fluorescenza
Alcune sostanze nelle cellule, come la clorofilla, possono emettere fluorescenza dopo essere state irradiate dai raggi ultravioletti; alcune sostanze stesse non possono emettere fluorescenza, ma se sono colorate con coloranti fluorescenti o anticorpi fluorescenti, possono anche emettere fluorescenza se irradiate da raggi ultravioletti e il microscopio a fluorescenza (Fig. 2-2, 3, 4) è uno degli strumenti per la ricerca qualitativa e quantitativa su tali sostanze.
I microscopi a fluorescenza e i microscopi ordinari presentano le seguenti differenze:
1. Il metodo di illuminazione è solitamente epi-illuminazione, ovvero la sorgente luminosa viene proiettata sul campione attraverso la lente dell'obiettivo (Figura 2-3);
2. La sorgente luminosa è la luce ultravioletta, la lunghezza d'onda è più corta e la risoluzione è superiore a quella dei normali microscopi;
3. Esistono due filtri speciali, quello davanti alla sorgente luminosa viene utilizzato per filtrare la luce visibile e quello tra l'oculare e la lente dell'obiettivo viene utilizzato per filtrare la luce ultravioletta per proteggere gli occhi.
(3) Microscopio confocale a scansione laser
Il microscopio a scansione confocale laser (microscopio a scansione confocale laser, Figura 2-5, 6) utilizza il laser come sorgente di luce di scansione e scansiona l'imaging punto per punto, linea per linea, superficie per superficie, e il laser a scansione e la raccolta di fluorescenza condividono un lente dell'obiettivo e la messa a fuoco della lente dell'obiettivo è Il punto focale del laser di scansione è anche il punto dell'oggetto dell'imaging istantaneo. Poiché la lunghezza d'onda del raggio laser è breve e il raggio è molto sottile, il microscopio confocale a scansione laser ha una risoluzione maggiore, che è circa 3 volte quella di un normale microscopio ottico. Il sistema viene messo a fuoco una volta e la scansione è limitata a un piano del campione. Quando la profondità di messa a fuoco è diversa, è possibile ottenere immagini di diversi livelli di profondità del campione. Queste informazioni sull'immagine sono memorizzate nel computer. Attraverso l'analisi e la simulazione al computer, è possibile visualizzare la struttura tridimensionale del campione cellulare.
La microscopia confocale a scansione laser può essere utilizzata non solo per osservare la morfologia cellulare, ma anche per l'analisi quantitativa dei componenti biochimici intracellulari, statistiche sulla densità ottica e misurazione della morfologia cellulare.
(4) Microscopio a campo oscuro
Il microscopio a campo oscuro (microscopio a campo oscuro, Figura 2-7) ha un foglio luminoso al centro del condensatore, in modo che la luce dell'illuminazione non entri direttamente nell'obiettivo umano e solo la luce riflessa e diffratta dal campione è consentito entrare nell'obiettivo, quindi lo sfondo del campo visivo è nero, i bordi degli oggetti sono luminosi. Usando questo microscopio, si possono vedere particelle piccole fino a 4-200nm e la risoluzione può essere 50 volte superiore a quella dei normali microscopi.
(5) Microscopio a contrasto di fase
Il microscopio a contrasto di fase (microscopio a contrasto di fase, Figura 2-8, 9) di P. Zernike fu inventato nel 1932 e per questo vinse il Premio Nobel per la Fisica nel 1953. La più grande caratteristica di questo microscopio è che può osservare campioni non colorati e cellule viventi.
Il principio di base della microscopia a contrasto di fase consiste nel modificare la differenza del percorso ottico della luce visibile che passa attraverso il campione in una differenza di ampiezza, migliorando così il contrasto tra le varie strutture e rendendo le varie strutture chiaramente visibili. Dopo aver attraversato il campione, la luce viene rifratta, deviata dal percorso ottico originale e ritardata di 1/4λ (lunghezza d'onda). Rafforzare, aumentare o diminuire l'ampiezza, aumentare il contrasto. In termini di struttura, i microscopi a contrasto di fase hanno due caratteristiche speciali che sono diverse dai normali microscopi ottici:
1. Il diaframma anulare si trova tra la sorgente luminosa e il condensatore e la sua funzione è quella di fare in modo che la luce che passa attraverso il condensatore formi un cono di luce cavo e si concentri sul campione.
2. Il piatto di fase (piatto di fase anulare) aggiunge un piatto di fase rivestito con fluoruro di magnesio nella lente dell'obiettivo, che può ritardare la fase della luce diretta o della luce diffratta di 1/4λ. Ci sono due tipi:
①A plus phase plate: la luce diretta viene ritardata di 1/4λ. Dopo che i due gruppi di onde luminose sono stati combinati, le onde luminose vengono sommate e l'ampiezza viene aumentata. La struttura del campione è più luminosa del mezzo circostante, formando un contrasto luminoso (o contrasto negativo).
② B più piastra di fase: la luce diffratta viene ritardata di 1/4λ. Dopo che le due serie di raggi sono state combinate, le onde luminose vengono sottratte e l'ampiezza si riduce, formando un contrasto scuro (o contrasto positivo) e la struttura è più scura del mezzo circostante.
