Applicazione della microscopia di fluorescenza a riflessione interna totale di fluorescenza
TIRFM (microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale), microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale, quando la luce entra in un mezzo con un indice di rifrazione inferiore da un mezzo con un indice di rifrazione elevato, se l'angolo incidente è abbastanza grande, tutta la luce viene riflessa senza rifrazione, ma in L'interfaccia dei due media produce onde evanescenti che possono eccitare la fluorescenza entro 100 nm vicino all'interfaccia per realizzare l'osservazione della superficie dell'oggetto. La luce di eccitazione può essere inviata attraverso l'illuminatore di un microscopio a fluorescenza convenzionale o un illuminatore speciale e l'angolo di incidenza del laser può essere controllato. Il metodo di eccitazione del campo istantaneo viene utilizzato per impedire alla luce di eccitazione di entrare nel rivelatore. La luce di eccitazione all'interfaccia tra vetro e acqua produce un interno completo implementato per riflessione. A causa dell'attenuazione esponenziale della luce di eccitazione, solo l'area del campione molto vicina alla superficie di riflessione totale produrrà un riflesso di fluorescenza, che riduce notevolmente l'interferenza del rumore della luce di fondo sul bersaglio di osservazione, quindi questa tecnologia è ampiamente utilizzata nell'osservazione dinamica delle sostanze di superficie cellulare.
Diagramma schematico della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM)
①Campione ②Gamma dell'onda evanescente ③Coperchio in vetro ④Immersione in olio ⑤Target ⑥Raggio di emissione (segnale) ⑦Raggio di eccitazione
Per ottenere una riflessione interna totale, è necessario un ampio angolo di incidenza, ad esempio, l'angolo di incidenza all'interfaccia vetro-acqua è maggiore di 61 gradi. Ciò può essere ottenuto da un prisma, chiamato TIRFM basato su prisma, o da una lente dell'obiettivo con un'apertura numerica elevata, che è chiamata TIRFM di tipo obiettivo. Gli attuali microscopi a fluorescenza a riflessione interna totale commercializzati sono generalmente del tipo a lenti obiettive, ad alta velocità e ad alta precisione.
La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale è ampiamente utilizzata in alcuni campi biologici perché può realizzare l'osservazione della fluorescenza in un intervallo molto sottile (meno di 100 nm) sulla superficie degli oggetti. Come le seguenti applicazioni:
Osservazione delle immagini della superficie cellulare: struttura della superficie della membrana cellulare, contatto della superficie cellulare, dinamica della superficie della membrana/localizzazione delle proteine.
Osservazione e manipolazione di singole molecole: miosina, actina e ATP marcato con Cy3-.
Movimento della superficie della membrana cellulare: come l'ingorgo della vescicola, l'espirazione della vescicola e l'esocrina della vescicola. IL
Osservazione del fenomeno dello sparking del calcio nella membrana cellulare, monitoraggio del canale ionico.
Ricerca motoria molecolare: motori rotazionali, proteine del citoscheletro, polimeri, proteine G, proteine ad anello, motori nucleotidici.
Oltre al campo della biologia, ha anche buone applicazioni nel campo della chimica per l'osservazione delle strutture molecolari chimiche.
