Vantaggi e limiti dei microscopi a scansione laser multifotone
① L'eccitazione viene eseguita con luce rossa o infrarossa, con conseguente scarsa diffusione della luce. La diffusione da parte di piccole particelle è inversamente proporzionale alla quarta potenza della lunghezza d'onda.
② Senza un foro stenopeico, è possibile raccogliere più fotoni sparsi dal piano di imaging.
③ I fori stenopeici non possono distinguere i fotoni sparsi emessi dalle regioni fuori fuoco o dal punto focale. La microscopia multifotone offre un buon rapporto segnale-rumore per l'imaging dei tessuti profondi.
④ La luce ultravioletta o visibile utilizzata nell'eccitazione di un singolo fotone tende ad essere assorbita e attenuata dal campione prima che il raggio raggiunga il piano focale, rendendo difficile l'eccitazione dello strato profondo.
⑤ Per l'osservazione microscopica biologica, la considerazione principale è preservare l'attività biologica dei campioni, mantenendo il contenuto di acqua, la concentrazione di ioni e la circolazione di ossigeno e sostanze nutritive. Per l'osservazione ottica, sia il calore che l'energia dei fotoni devono essere mantenuti entro livelli di irradiazione che non danneggino le cellule.
⑥ I microscopi multifotone presentano numerosi vantaggi. In termini di risoluzione 3D, penetrazione profonda, efficienza di diffusione, luce di fondo, rapporto segnale-rumore e controllabilità, mostrano proprietà superiori che i microscopi laser convenzionali non possono eguagliare o ottenere.
Svantaggi dei microscopi a scansione laser multifotone
① Può eseguire solo imaging in fluorescenza.
② Se il campione contiene cromofori che assorbono la luce di eccitazione, potrebbe verificarsi un danno termico al campione.
③ La risoluzione è leggermente ridotta. Sebbene ciò possa essere migliorato utilizzando contemporaneamente un foro stenopeico confocale, si verificherà una perdita di segnale.
④ Limitati dai costosi laser ultraveloci, i microscopi a scansione multifotone hanno un costo relativamente elevato.
