Un confronto tra diverse tecniche di microscopia a super risoluzione
Per la microscopia ottica convenzionale, la diffrazione della luce limita la risoluzione dell'immagine a circa 250 nm. Oggi, le tecniche di super-risoluzione possono migliorarlo di oltre un fattore 10. Questa tecnica si ottiene principalmente attraverso tre metodi: microscopia di localizzazione a singola molecola, inclusa la microscopia di localizzazione fotosensibile (PALM) e la microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM); microscopia a illuminazione strutturata (SIM); e microscopia ad esaurimento delle emissioni stimolate (STED). Come scegliere la tecnologia a super risoluzione è ciò che interessa a tutti. "Sfortunatamente, non ci sono principi semplici per decidere quale metodo utilizzare", afferma Mathew Stracy, ricercatore post-dottorato presso l'Università di Oxford, nel Regno Unito. "Ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi." Gli scienziati stanno ovviamente anche cercando di capire come scegliere il metodo giusto per un particolare progetto. "Nel contesto del bioimaging, i fattori chiave da considerare includono: risoluzione spaziale e temporale, sensibilità al fotodanneggiamento, capacità di etichettatura, spessore del campione e fluorescenza di fondo o fluorescenza cellulare autologa". Come funziona I vari microscopi a super risoluzione funzionano in modi diversi. Nel caso di PALM e STORM, solo una piccola frazione di marcatori fluorescenti viene eccitata o fotoattivata in un dato momento, consentendo la loro localizzazione indipendente con elevata precisione. L'esecuzione di questo processo con tutte le etichette fluorescenti si traduce in un'immagine completa in super risoluzione. Stefan Hell, uno dei vincitori del Premio Nobel per la Chimica 2014 e direttore del Max Planck Institute of Biophysical Chemistry, ha dichiarato: "Il sistema PALM/STORM è relativamente facile da configurare, ma è difficile da applicare, perché il sistema fluorescente gruppo deve avere capacità di fotoattivazione Limitazioni Lo svantaggio è che devono rilevare una singola molecola fluorescente nel contesto di una cellula e sono meno affidabili di STED. STED utilizza un impulso laser per eccitare il fluoroforo e un laser a forma di anello per spegnere il fluoroforo, lasciando solo la fluorescenza intermedia di dimensioni nanometriche per la super-risoluzione. La scansione dell'intero campione produce un'immagine. "Il vantaggio di STED è che si tratta di una tecnologia a pulsante", ha spiegato Hell. "Funziona come un microscopio a fluorescenza confocale standard." Può anche visualizzare cellule vive utilizzando fluorofori come proteine fluorescenti verdi o gialle e coloranti derivati dalla rodamina. Confronto parametrico Sebbene tutte le tecniche di super-risoluzione superino la microscopia ottica convenzionale in termini di risoluzione, differiscono l'una dall'altra. SIM raddoppia approssimativamente la risoluzione a circa 100 nm. PALM e STORM possono risolvere bersagli a 15 nm. Secondo Hell, STED fornisce una risoluzione spaziale di 30 nm nelle cellule viventi e di 15 nm nelle cellule fisse. Quando si tratta di applicazioni specifiche, dobbiamo considerare anche il rapporto segnale/rumore. In alcuni casi, una risoluzione inferiore ma un SNR più elevato può produrre un'immagine migliore dell'opposto (risoluzione maggiore ma SNR inferiore). Anche la velocità di acquisizione dell'immagine è molto importante, soprattutto per le cellule viventi. "Tutte le tecniche di super-risoluzione sono più lente delle tradizionali tecniche di imaging a fluorescenza", ha affermato Stracy. "PALM/STORM è il più lento, ha bisogno di decine di migliaia di fotogrammi per ottenere una singola immagine, SIM ha bisogno di dozzine di fotogrammi e STED è una tecnologia di scansione, quindi la velocità di acquisizione dipende dalla dimensione del campo visivo." Oltre alle cellule viventi o alle cellule di imaging fisse, alcuni scienziati vogliono anche capire come si muovono gli oggetti. Stracy è interessata a comprendere le dinamiche dei sistemi biologici nelle cellule viventi, non solo le immagini statiche. Combina PALM con il tracciamento di singole particelle per analizzare le dinamiche nelle cellule viventi. In questo modo, può tracciare direttamente le molecole marcatrici mentre svolgono le loro funzioni. Tuttavia, ritiene che il SIM non sia adatto allo studio di questi processi dinamici a livello molecolare, ma a causa della sua elevata velocità di acquisizione, è particolarmente adatto per osservare la dinamica di strutture più grandi, come interi cromosomi. Gli ultimi risultati Nel 2017, il team di Hell ha riportato su Science il microscopio a super risoluzione MINFLUX. Secondo Hell, questo metodo di super-risoluzione raggiunge per la prima volta una risoluzione spaziale di 1 nm. Inoltre, può tracciare le singole molecole nelle cellule viventi almeno 100 volte più velocemente rispetto ad altri metodi. Anche altri scienziati hanno parlato molto bene del microscopio MINFLUX. "Nuove applicazioni e nuovi approcci vengono costantemente sviluppati, ma per me spiccano due progressi", ha affermato Shechtman. Uno è MINFLUX. "Utilizza un metodo ingegnoso per ottenere un posizionamento molecolare molto preciso". Per quanto riguarda il secondo entusiasmante sviluppo, Shechtman ha menzionato WE Moerner e i suoi colleghi della Stanford University. Moerner è stato anche il destinatario del Premio Nobel per la Chimica 2014. Uno dei vincitori. Per affrontare la limitazione della risoluzione dell'imaging causata dalla diffusione anisotropica di singole molecole fluorescenti, gli scienziati hanno utilizzato diverse polarizzazioni di eccitazione per determinare l'orientamento e la posizione delle molecole. Inoltre, hanno sviluppato delicate superfici pupillari. Queste tecniche migliorano la capacità di localizzare le strutture. Informazioni sulle etichette fluorescenti In molte applicazioni ad alta risoluzione, le etichette contano davvero. Ci sono anche alcune aziende che forniscono prodotti correlati. Ad esempio, la tedesca Miltenyi ha collaborato con Abberior, una società fondata da Stefan Hell, per fornire servizi personalizzati di coniugazione di anticorpi per coloranti per microscopia a super risoluzione. Un certo numero di altre aziende offre anche marcatori corrispondenti. "I nostri Nano-Booster sono molto piccoli, solo 1,5 kDa e altamente specifici", afferma Christoph Eckert, responsabile marketing di ChromoTek. Queste proteine legano proteine fluorescenti verdi e rosse (GFP e RFP). Derivano da frammenti di anticorpi di alpaca, noti come VHH o nanobodies, con eccellenti proprietà di legame e qualità stabile senza variazioni da lotto a lotto. Questi marcatori sono adatti a varie tecniche di super risoluzione tra cui SIM, PALM, STORM e STED. Ai-Hui Tang, assistente professore presso la School of Medicine dell'Università del Maryland, e colleghi hanno utilizzato GFP-Booster e STORM di ChromoTek per esplorare la propagazione delle informazioni nel sistema nervoso. Hanno trovato nanocluster molecolari, chiamati nanocolonne, nei neuroni presinaptici e postsinaptici. Gli scienziati ritengono che questa struttura dimostri che il sistema nervoso centrale impiega principi semplici per mantenere e regolare l'efficienza sinaptica. Varie versioni dell'imaging a super risoluzione e un numero crescente di metodi stanno portando gli scienziati ancora più in profondità nei misteri biologici. Rompendo il limite di diffrazione della luce visibile, i biologi possono persino "monitorare da vicino" le azioni delle cellule.
