Ci sono molti vantaggi nella microscopia a fluorescenza a due fotoni
1) La luce a lunghezza d'onda lunga è meno influenzata dalla diffusione rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta e può penetrare facilmente nel campione;
2) Le molecole fluorescenti all'esterno del piano focale non vengono eccitate, consentendo a una maggiore quantità di luce di eccitazione di raggiungere il piano focale, consentendo alla luce di eccitazione di penetrare nei campioni più profondi;
3) La luce del vicino infrarosso a lunghezza d'onda lunga è meno tossica per le cellule rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta;
4) Quando si osservano campioni utilizzando un microscopio a due fotoni, il fotosbiancamento e la fototossicità si verificano solo sul piano focale. Pertanto, i microscopi a due fotoni sono più adatti dei microscopi a fotone singolo per l'osservazione di campioni spessi, per l'osservazione di cellule viventi o per eseguire esperimenti di fotosbiancamento a punto fisso.
Conoscenza della microscopia confocale a fluorescenza
Il principio di base della microscopia confocale a fluorescenza: utilizzare una sorgente luminosa puntiforme per illuminare il campione in modo da formare un punto luminoso piccolo e ben definito sul piano focale. La fluorescenza emessa dallo spot dopo essere stato illuminato viene raccolta dalla lente dell'obiettivo e restituita allo specchio dicroico lungo il percorso luminoso dell'illuminazione originale. costituiscono un divisore di fascio. Lo spettrometro invia la fluorescenza direttamente al rilevatore. Davanti alla sorgente luminosa e al rilevatore è presente un foro stenopeico, chiamato rispettivamente foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevamento. Le dimensioni geometriche dei due sono coerenti, circa 100-200nm; rispetto al punto luminoso sul piano focale, i due sono coniugati, ovvero il punto luminoso attraversa una serie di lenti e alla fine può essere focalizzato contemporaneamente sul foro stenopeico di illuminazione e su quello stenopeico di rilevamento. In questo modo la luce proveniente dal piano focale può essere concentrata all'interno del foro di rilevamento, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata all'esterno del foro di rilevamento e non può essere ripresa. Il campione viene scansionato punto per punto con il laser, e il tubo fotomoltiplicatore dietro al foro stenopeico di rilevamento ottiene punto per punto anche l'immagine confocale del punto luminoso corrispondente, che viene convertita in segnale digitale e trasmessa al computer, ed infine aggregata sullo schermo in un'immagine confocale chiara dell'intero piano focale. .
Ciascuna immagine del piano focale è in realtà una sezione trasversale ottica del campione. Questa sezione trasversale ottica ha sempre un certo spessore ed è anche chiamata sezione sottile ottica. Poiché l'intensità della luce nel fuoco è molto maggiore dell'intensità della luce nel non fuoco e la luce sul piano non focale è filtrata dal foro stenopeico, la profondità di campo del sistema confocale è approssimativamente zero. La scansione lungo la direzione dell'asse Z può realizzare la tomografia ottica, formando la sezione ottica bidimensionale desiderata nel punto focalizzato del campione. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), accumulando livelli continui di immagini bidimensionali ed elaborandole con un software specializzato, è possibile ottenere un'immagine tridimensionale del campione.
Cioè, il foro stenopeico di rilevamento e quello della sorgente luminosa sono sempre focalizzati sullo stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata all'esterno del piano di messa a fuoco non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
La semplice espressione del principio di funzionamento del laser confocale è che utilizza il laser come sorgente luminosa. Sulla base dell'imaging tradizionale del microscopio a fluorescenza, vengono aggiunti un dispositivo di scansione laser e un dispositivo di messa a fuoco coniugata e il sistema è controllato da un computer per raccogliere ed elaborare le immagini digitali.
