Struttura di base della microscopia confocale a fluorescenza
(1) Modulo di scansione
Il modulo di scansione è costituito principalmente da una barra luminosa stenopeica (che controlla lo spessore delle fette ottiche), uno spettroscopio (che cambia la direzione della propagazione della luce in base alla lunghezza d'onda), un colorimetro a fluorescenza a emissione (che seleziona la luce entro un determinato intervallo di lunghezze d'onda per il rilevamento) e un rivelatore (tubo fotomoltiplicatore). La fluorescenza mista nel campione fluorescente entra nello scanner e, dopo essere stata selezionata dalla barra luminosa stenopeica di rilevamento, dallo spettrometro e dal colorimetro, viene divisa in varie fluorescenze monocromatiche, che vengono rilevate in diversi canali di fluorescenza e formano immagini confocali corrispondenti. Allo stesso tempo, sullo schermo del computer possono essere visualizzate diverse immagini fluorescenti monocromatiche parallele e le relative immagini composite.
(2) Sistema di microscopia a fluorescenza
Il microscopio è il componente principale di LSCM, correlato alla qualità dell'immagine del sistema. Il percorso ottico del microscopio può essere facilmente inserito in un sistema ottico a distanza infinita con opzioni ottiche senza compromettere la qualità dell'immagine e l'accuratezza della misurazione. L'obiettivo dovrebbe essere un obiettivo apocromatico a campo piatto con ampia apertura numerica, utile per l'acquisizione della fluorescenza e l'imaging chiaro. La conversione del gruppo di lenti dell'obiettivo, la selezione del gruppo di filtri colorati, la regolazione del movimento del tavolino e il blocco della memoria del piano focale dovrebbero essere tutti controllati automaticamente dal computer.
Il microscopio a fluorescenza utilizzato nella microscopia confocale a scansione laser è generalmente uguale a un microscopio a fluorescenza convenzionale, ma ha le sue caratteristiche: deve essere collegato a uno scanner, in modo che il laser possa entrare nell'obiettivo del microscopio per irradiare il campione e rendere la fluorescenza emessa dal campione raggiunge il rivelatore; È necessario un dispositivo di conversione del percorso luminoso, che converta le lampade al mercurio in laser, e l'intensità della luce della lampada al mercurio può essere regolata.
(3) Laser comuni
Le sorgenti laser utilizzate nella microscopia confocale a scansione laser includono sistemi laser singoli e multi-laser, e i laser comunemente usati includono i seguenti tre tipi:
Laser a semiconduttore: 405 nm (vicino alla linea spettrale ultravioletta)
Laser agli ioni di argon: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (luce verde blu)
Laser He-Ne: 543 nm (laser verde He-Ne a luce verde) 633 nm (laser rosso He-Ne a luce rossa)
Laser UV (laser UV): 351 nm, 364 nm (luce UV)
(4) Attrezzatura ausiliaria
Sistemi di raffreddamento raffreddati ad aria e ad acqua e alimentatori regolati.
Il principio di funzionamento di base di un microscopio confocale a scansione laser è quello di emettere prima una certa lunghezza d'onda di luce di eccitazione dal laser. Dopo l'amplificazione, la luce passa attraverso la barra luminosa a foro stenopeico illuminata nello scanner per formare una sorgente luminosa puntiforme. La lente dell'obiettivo si concentra sul piano focale del campione e i corrispondenti punti illuminati sul campione vengono eccitati ed emettono fluorescenza. Dopo aver attraversato la barra luminosa del foro di rilevamento, raggiunge il rilevatore e viene visualizzata sullo schermo di monitoraggio del computer. In questo modo, dalle immagini in fluorescenza di ogni punto del campione sul piano focale si forma un'immagine confocale completa, chiamata fetta di luce.
