Perché è necessario utilizzare un microscopio confocale?
1. I microscopi ottici hanno raggiunto uno stato di perfezione grazie agli sforzi e ai miglioramenti dei nostri grandi predecessori. Infatti, i normali microscopi possono fornirci bellissime immagini microscopiche in modo semplice e rapido. Tuttavia, si è verificato un evento che ha portato un’innovazione rivoluzionaria in questo mondo quasi perfetto della microscopia. Questa è stata l'invenzione del "microscopio confocale a scansione laser". La caratteristica di questo nuovo tipo di microscopio è che utilizza un sistema ottico che estrae le informazioni dell'immagine solo sulla superficie su cui è focalizzato il fuoco e ripristina le informazioni ottenute nella memoria dell'immagine mentre si cambia la messa a fuoco, ottenendo così informazioni 3D complete. Un'immagine vivida dell'intelligenza. Attraverso questo metodo è possibile ottenere facilmente informazioni sulla forma della superficie che non possono essere confermate con un normale microscopio. Inoltre, per i normali microscopi ottici, "l'aumento della risoluzione" e "l'aumento della profondità di campo" sono condizioni contrastanti, soprattutto ad alti ingrandimenti. Tuttavia, nella microscopia confocale, questo problema è facilmente risolvibile.
2. Vantaggi del sistema ottico confocale
Il sistema ottico confocale esegue un'illuminazione puntiforme sul campione e la luce riflessa utilizza anche un recettore puntiforme per ricevere la luce. Quando il campione viene posizionato nella posizione di messa a fuoco, quasi tutta la luce riflessa può raggiungere il fotorecettore. Quando il campione è fuori fuoco, la luce riflessa non può raggiungere il fotorecettore. In altre parole, nel sistema ottico confocale, verrà emessa solo l'immagine che coincide con il fuoco e i punti luminosi e la luce diffusa inutile verranno schermati.
3. Perché usare il laser?
Nel sistema ottico confocale, il campione viene illuminato in un punto e anche la luce riflessa viene ricevuta tramite un fotorecettore puntiforme. Diventano quindi necessarie sorgenti luminose puntiformi. I laser sono sorgenti luminose molto puntiformi. Nella maggior parte dei casi, la sorgente luminosa dei microscopi confocali utilizza sorgenti luminose laser. Inoltre, anche le caratteristiche del laser come la monocromaticità, la direttività e l'eccellente forma del fascio sono ragioni importanti per la sua diffusa adozione.
4. Diventa possibile l'osservazione in tempo reale basata sulla scansione ad alta velocità
Per la scansione laser viene utilizzato un deflettore ottico acustico (elemento AO) in direzione orizzontale e uno specchio per la scansione del raggio controllato elettricamente (Servo Galvano-mirror) in direzione verticale. Poiché l'unità di deflessione ottico-acustica non dispone di una parte meccanica di vibrazione, può eseguire la scansione ad alta velocità, rendendo possibile l'osservazione in tempo reale sullo schermo di monitoraggio. L'elevata velocità di questo tipo di imaging è un elemento molto importante che influisce direttamente sulla velocità di messa a fuoco e di recupero della posizione.
5. La relazione tra posizione di messa a fuoco e luminosità
Nel sistema ottico confocale, la luminosità è massima quando il campione è posizionato correttamente nella posizione di messa a fuoco e la sua luminosità diminuirà bruscamente davanti e dietro di esso (linea continua nella Figura 4). Questa sensibile selettività del piano focale è anche il principio alla base della determinazione della direzione dell'altezza e dell'espansione della profondità di fuoco del microscopio confocale. Al contrario, un normale microscopio ottico non presenta evidenti cambiamenti di luminosità prima e dopo la posizione di messa a fuoco (linea tratteggiata nella Figura 4).
6. Contrasto elevato e alta risoluzione
Nei normali microscopi ottici, la luce riflessa dalla parte fuori fuoco interferisce e si sovrappone alla parte messa a fuoco, con conseguente riduzione del contrasto dell'immagine. Al contrario, nel sistema ottico confocale, la luce diffusa all'esterno del fuoco e la luce diffusa all'interno dell'obiettivo vengono quasi completamente rimosse, quindi è possibile ottenere un'immagine con un contrasto molto elevato. Inoltre, poiché la luce attraversa due volte la lente dell'obiettivo, l'immagine puntiforme risulta più nitida, il che migliora anche il potere risolutivo del microscopio.
