Perché hai bisogno di un microscopio confocale?
1. Dopo gli sforzi e i miglioramenti dei nostri grandi predecessori, il microscopio ottico ha raggiunto il punto di perfezione. Infatti, i normali microscopi possono fornirci bellissime immagini microscopiche in modo semplice e rapido. Tuttavia, si è verificato un evento che ha portato un'innovazione rivoluzionaria in questo mondo di microscopi quasi perfetto, ovvero l'invenzione del "microscopio confocale a scansione laser". La caratteristica di questo nuovo tipo di microscopio è che adotta un sistema ottico che estrae le informazioni dell'immagine solo sulla superficie in cui è concentrato il fuoco e ripristina le informazioni ottenute nella memoria dell'immagine mentre cambia il fuoco, in modo che le informazioni 3D complete possano essere ottenuto. Una cruda immagine di intelligenza. Con questo metodo è possibile ottenere facilmente informazioni sulla forma della superficie che non possono essere confermate con un normale microscopio. Inoltre, per i normali microscopi ottici, "l'aumento della risoluzione" e "l'approfondimento della profondità di fuoco" sono condizioni contraddittorie, specialmente ad alti ingrandimenti, questa contraddizione è più evidente, ma in termini di microscopi confocali, questo problema è facilmente risolvibile.
2. Vantaggi del sistema ottico confocale
Il sistema ottico confocale esegue l'illuminazione puntiforme sul campione e la luce riflessa viene ricevuta anche dal recettore puntiforme. Quando il campione è posto nella posizione di messa a fuoco, quasi tutta la luce riflessa può raggiungere il fotorecettore e quando il campione è fuori fuoco, la luce riflessa non può raggiungere il fotorecettore. Vale a dire, nel sistema ottico confocale, verrà emessa solo l'immagine che coincide con il punto focale, e verranno schermati i punti luminosi e la luce diffusa inutile.
3. Perché usare il laser?
Nel sistema ottico confocale, il campione viene illuminato in un punto e anche la luce riflessa viene ricevuta da un fotorecettore puntiforme. Pertanto, diventa necessaria una sorgente luminosa puntiforme. I laser sono fonti di luce molto puntiformi. Nella maggior parte dei casi, le sorgenti luminose laser vengono utilizzate come sorgenti luminose per microscopi confocali. Inoltre, anche le caratteristiche di monocromaticità, direzionalità e l'eccellente forma del raggio del laser sono motivi importanti per la sua ampia adozione.
4. Diventa possibile l'osservazione in tempo reale basata sulla scansione ad alta velocità
Per la scansione laser, la direzione orizzontale adotta il deflettore ottico acustico (elemento AO) e la direzione verticale adotta lo specchio di scansione del raggio servocontrollato elettronicamente (Servo Galvano-mirror). Poiché l'unità di deflessione acusto-ottica non ha alcuna parte di vibrazione meccanica, può eseguire la scansione ad alta velocità ed è possibile l'osservazione in tempo reale sullo schermo del monitor. Questa immagine ad alta velocità è un elemento molto importante che influisce direttamente sulla velocità di messa a fuoco e sul recupero della posizione.
5. La relazione tra posizione di messa a fuoco e luminosità
Nel sistema ottico confocale, la luminosità del campione è massima quando il campione è posizionato correttamente nella posizione focale e la sua luminosità diminuirà bruscamente prima e dopo (la linea continua nella Figura 4). La sensibile selettività del piano focale è anche il principio della determinazione della direzione dell'altezza del microscopio confocale e dell'espansione della profondità focale. Al contrario, i normali microscopi ottici non presentano evidenti variazioni di luminosità prima e dopo la posizione di messa a fuoco
6. Alto contrasto, alta risoluzione
Nei normali microscopi ottici, a causa dell'interferenza della luce riflessa dalla parte di messa a fuoco, si sovrappone alla parte di imaging di messa a fuoco, determinando una diminuzione del contrasto dell'immagine. Nel sistema ottico confocale, invece, la luce diffusa all'esterno del punto focale e la luce diffusa all'interno della lente dell'obiettivo vengono quasi completamente rimosse, in modo da ottenere un'immagine ad altissimo contrasto. Inoltre, poiché la luce passa due volte attraverso la lente dell'obiettivo, l'immagine puntiforme viene messa a fuoco per prima, il che migliora anche il potere risolutivo del microscopio.
7. Funzione di localizzazione ottica
Nel sistema ottico confocale, la luce riflessa diversa dal punto coincidente con il punto focale è schermata dal microporo. Pertanto, quando si osserva un campione tridimensionale, si forma un'immagine come se il campione fosse tagliato con il piano focale. Questo effetto è noto come localizzazione ottica ed è una delle specialità dei sistemi ottici confocali.
8. Mettere a fuoco la funzione di memoria mobile
La cosiddetta luce riflessa al di fuori del punto focale è schermata dai micropori. Si può invece ritenere che tutti i punti dell'immagine formata dal sistema ottico confocale coincidano con il punto focale. Pertanto, se il campione tridimensionale viene spostato lungo l'asse Z (asse ottico), le immagini vengono accumulate e immagazzinate nella memoria, e infine si otterrà l'immagine formata dall'intero campione e dal punto focale. La funzione di approfondire all'infinito la profondità di messa a fuoco in questo modo è chiamata funzione della memoria mobile.
9. Funzione di misurazione della forma della superficie
In termini di funzione di spostamento della messa a fuoco, la forma della superficie del campione può essere misurata senza contatto aggiungendo un circuito di registrazione dell'altezza della superficie. Sulla base di questa funzione è possibile registrare le coordinate dell'asse Z formate dal valore massimo di luminanza in ciascun pixel e, sulla base di queste informazioni, ottenere informazioni relative alla forma della superficie del campione.
10. Funzione di misurazione di micro-dimensioni ad alta precisione
L'unità di ricezione della luce adotta un 1-sensore di imaging CCD dimensionale, quindi non è influenzato dall'inclinazione di scansione del dispositivo di scansione, in modo da poter completare la misurazione ad alta precisione. Inoltre, grazie all'uso della funzione di memoria dello spostamento della messa a fuoco con profondità di messa a fuoco regolabile (approfondimento), è possibile eliminare l'errore di misurazione causato dallo spostamento della messa a fuoco.
11. Analisi dell'immagine tridimensionale
Utilizzando la funzione di misurazione della forma della superficie, è possibile creare facilmente un'immagine tridimensionale della superficie del campione. Non solo, ma può anche eseguire una varietà di analisi come: misurazione della rugosità superficiale, area, volume, superficie, circolarità, raggio, lunghezza massima, perimetro, centro di gravità, immagine tomografica, trasformazione FFT, misurazione della larghezza della linea, ecc. .
Il microscopio a scansione confocale laser può essere utilizzato non solo per osservare la morfologia cellulare, ma anche per l'analisi quantitativa dei componenti biochimici intracellulari, statistiche sulla densità ottica e misurazione della morfologia cellulare.
