Cos'è la microscopia a fluorescenza a due fotoni
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è: nel caso di un'elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire due fotoni a lunghezza d'onda lunga contemporaneamente ed emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta dopo un breve periodo della cosiddetta durata dello stato eccitato . ; l'effetto è lo stesso che si ottiene usando un fotone la cui lunghezza d'onda è metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare una molecola fluorescente. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni. Per non danneggiare le cellule, la microscopia a due fotoni utilizza laser pulsati bloccati in modalità ad alta energia. Il laser emesso da questo laser ha un'energia di picco elevata e un'energia media bassa, la sua larghezza di impulso è di soli 100 femtosecondi e la sua frequenza può raggiungere da 80 a 100 megahertz. Quando si utilizza una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni del laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione a due fotoni si verifica solo nel punto focale della lente dell'obiettivo, quindi il microscopio a due fotoni non necessita di un foro stenopeico confocale, il che migliora l'efficienza di rilevamento della fluorescenza.
Nei fenomeni generali di fluorescenza, a causa della bassa densità di fotoni della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone alla volta e quindi emettere un fotone fluorescente attraverso una transizione radiativa, che è la fluorescenza a singolo fotone. Per il processo di eccitazione della fluorescenza che utilizza il laser come sorgente luminosa, può verificarsi una fluorescenza a due fotoni o anche a più fotoni. In questo momento, l'intensità della sorgente luminosa di eccitazione utilizzata è elevata e la densità dei fotoni soddisfa i requisiti delle molecole fluorescenti che assorbono due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo di un laser generale come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni non è ancora sufficiente per produrre il fenomeno dell'assorbimento a due fotoni. Di solito viene utilizzato un laser pulsato a femtosecondi e la sua potenza istantanea può raggiungere l'ordine dei megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è più corta della lunghezza d'onda della luce di eccitazione, che è equivalente all'effetto prodotto dall'eccitazione a metà della lunghezza d'onda di eccitazione.
