Il principale metodo di osservazione del microscopio ottico è l'osservazione della fluorescenza
La fluorescenza si riferisce al processo in cui una sostanza fluorescente emette luce con una lunghezza d'onda maggiore quasi simultaneamente quando viene irradiata con luce di una lunghezza d'onda specifica (Figura 1). Quando la luce di una lunghezza d'onda specifica (lunghezza d'onda di eccitazione) colpisce una molecola, come quelle in un fluoroforo, l'energia del fotone viene assorbita dagli elettroni della molecola. Successivamente, gli elettroni passano dallo stato fondamentale (S0) a un livello di energia più elevato, lo stato eccitato (S1'). Questo processo è chiamato eccitazione①. L'elettrone rimane nello stato eccitato per 10-9–10-8 secondi, durante i quali l'elettrone perde energia②. Durante il processo di uscita degli elettroni dallo stato eccitato (S1) e ritorno allo stato fondamentale③, viene rilasciata l'energia residua assorbita durante il processo di eccitazione.
Il tempo di permanenza della molecola fluorescente nello stato eccitato è la durata della fluorescenza, che è generalmente a livello di nanosecondi, ed è una caratteristica intrinseca della molecola fluorescente stessa. L'imaging a vita in fluorescenza (FLIM), che utilizza la tecnologia di imaging a vita in fluorescenza, è chiamato imaging a vita in fluorescenza (FLIM). Oltre all'imaging dell'intensità della fluorescenza, è possibile ottenere misurazioni funzionali e accurate più approfondite per ottenere la conformazione molecolare, le interazioni intermolecolari e il microambiente delle molecole. Informazioni difficili da ottenere con l'imaging ottico convenzionale.
Un'altra proprietà importante della fluorescenza è lo spostamento di Stokes, la differenza di lunghezza d'onda tra i picchi di eccitazione e di emissione (Figura 2). Tipicamente la lunghezza d'onda di emissione è maggiore della lunghezza d'onda di eccitazione. Questo perché gli elettroni perderanno parte della loro energia attraverso il processo di rilassamento dopo che la sostanza fluorescente è stata eccitata e prima di rilasciare fotoni. Le sostanze fluorescenti con spostamenti di Stokes maggiori sono più facili da osservare al microscopio a fluorescenza.
Microscopia a fluorescenza e cubi filtro a fluorescenza
Il microscopio a fluorescenza è un microscopio ottico che utilizza le proprietà di fluorescenza per l'osservazione e l'imaging ed è ampiamente utilizzato in vari campi come la biologia cellulare, la neurobiologia, la botanica, la microbiologia, la patologia e la genetica. L'imaging a fluorescenza presenta i vantaggi dell'elevata sensibilità e dell'elevata specificità ed è molto adatto per l'osservazione della distribuzione di proteine e organelli specifici nei tessuti e nelle cellule, lo studio della colocalizzazione e dell'interazione, il monitoraggio dei processi dinamici della vita come i cambiamenti della concentrazione di ioni , eccetera.
La maggior parte delle molecole nelle cellule non emette fluorescenza e per vederle devono essere etichettate in modo fluorescente. Esistono molti metodi di etichettatura fluorescente, come l'etichettatura diretta (come l'utilizzo di DAPI per etichettare il DNA), o l'immunocolorazione utilizzando le proprietà di legame dell'antigene degli anticorpi o l'utilizzo di proteine fluorescenti (come GFP, proteina fluorescente verde) per etichettare le proteine bersaglio e rilegatura reversibile. Coloranti sintetici (come Fura-2) e così via.
Al momento, il microscopio a fluorescenza è diventato l'apparecchiatura di imaging standard di vari laboratori e piattaforme di imaging ed è un valido aiuto per i nostri esperimenti quotidiani. I microscopi a fluorescenza si dividono principalmente in tre categorie: microscopi a fluorescenza diritti (adatti per lo slicing), microscopi a fluorescenza invertiti (adatti per cellule viventi, tenendo conto dello slicing), stereoscopi fluorescenti (adatti per campioni più grandi, come piante, pesci zebra (adulti/embrioni ) , medaka, organi di topo/ratto, ecc.).
Il blocco del filtro di fluorescenza è il componente principale dell'imaging a fluorescenza del microscopio. Si compone di tre parti: filtro di eccitazione, filtro di emissione e divisore di fascio dicroico. È installato nella ruota portafiltri. Ad esempio, Leica DMi8 è dotato di una 6-ruota portafiltri di posizione (Fig. 3 ). Il numero di posizioni delle diverse ruote del microscopio sarà diverso e alcuni microscopi utilizzano vetrini con blocco filtro.
Il blocco del filtro svolge un ruolo importante nell'imaging a fluorescenza: il filtro di eccitazione seleziona la luce di eccitazione per eccitare il campione e blocca la luce di altre lunghezze d'onda; la luce che passa attraverso il filtro di eccitazione passa attraverso lo specchio dicroico (la sua funzione è di riflettere la luce di eccitazione e trasmettere la fluorescenza), dopo la riflessione viene focalizzata dalla lente dell'obiettivo, irradia il campione ed eccita la corrispondente fluorescenza, cioè , luce emessa. La luce emessa viene raccolta dalla lente dell'obiettivo, passa attraverso il divisore di fascio dicroico e raggiunge il filtro di emissione. Come mostrato nella Figura 4: la lunghezza d'onda di eccitazione è 450-490nm, lo specchio dicroico riflette la luce più corta di 510nm, trasmette la luce più lunga di 510nm e l'intervallo di ricezione della luce emessa è 520-560nm.
