Il principale metodo di osservazione del microscopio ottico è l'osservazione della fluorescenza
Fenomeno di fluorescenza
La fluorescenza si riferisce al processo in cui una sostanza fluorescente emette luce con una lunghezza d'onda maggiore quasi simultaneamente quando irradiata con luce di una lunghezza d'onda specifica (Figura 1). Quando la luce di una lunghezza d'onda specifica (lunghezza d'onda di eccitazione) colpisce una molecola (come una molecola in un fluoroforo), l'energia del fotone viene assorbita dagli elettroni della molecola. Successivamente, gli elettroni passano dallo stato fondamentale (S0) a un livello di energia più elevato, lo stato eccitato (S1'). Questo processo è chiamato eccitazione①. L'elettrone rimane nello stato eccitato per 10-9–10-8 secondi, durante i quali l'elettrone perde energia ②. Nel processo di uscita dallo stato eccitato (S1) e ritorno allo stato fondamentale ③, verrà rilasciata l'energia residua assorbita durante il processo di eccitazione.
Il tempo di permanenza di una molecola fluorescente nello stato eccitato è la durata della fluorescenza, generalmente in nanosecondi, che è una caratteristica intrinseca della molecola fluorescente stessa. La tecnologia di imaging che utilizza la durata della fluorescenza è chiamata Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), che può eseguire misurazioni funzionali e accurate più approfondite oltre all'imaging dell'intensità della fluorescenza per ottenere conformazione molecolare, interazioni intermolecolari e microambienti molecolari. informazioni difficili da ottenere con l'imaging ottico convenzionale.
Un'altra proprietà importante della fluorescenza è lo spostamento di Stokes, la differenza di lunghezza d'onda tra i picchi di eccitazione e di emissione (Figura 2). Di solito la lunghezza d'onda della luce di emissione è maggiore della lunghezza d'onda della luce di eccitazione. Questo perché dopo che la sostanza fluorescente è stata eccitata e prima che il fotone venga rilasciato, gli elettroni perderanno una parte dell'energia attraverso il processo di rilassamento. Le sostanze fluorescenti con spostamenti di Stokes maggiori sono più facili da osservare al microscopio a fluorescenza.
Microscopi a fluorescenza e blocchi filtro a fluorescenza
La microscopia a fluorescenza è un microscopio ottico che utilizza proprietà di fluorescenza per osservare e visualizzare ed è ampiamente utilizzato in biologia cellulare, neurobiologia, botanica, microbiologia, patologia, genetica e altri campi. L'imaging a fluorescenza presenta i vantaggi dell'elevata sensibilità e dell'elevata specificità ed è molto adatto per l'osservazione della distribuzione di proteine specifiche, organelli, ecc. Nei tessuti e nelle cellule, lo studio della co-localizzazione e dell'interazione e il monitoraggio della dinamica della vita processi come i cambiamenti nella concentrazione di ioni.
La maggior parte delle molecole nelle cellule non emette fluorescenza e, per vederle, devono essere etichettate in modo fluorescente. Esistono molti metodi di etichettatura fluorescente, che possono essere etichettati direttamente (come l'uso di DAPI per etichettare il DNA), o l'immunocolorazione utilizzando le proprietà di legame dell'antigene degli anticorpi, oppure la proteina bersaglio può essere etichettata con proteine fluorescenti (come GFP, verde proteina fluorescente) o legame reversibile. coloranti sintetici (come Fura-2), ecc.
Al momento, il microscopio a fluorescenza è diventato l'apparecchiatura di imaging standard di vari laboratori e piattaforme di imaging ed è un valido aiuto per i nostri esperimenti quotidiani. I microscopi a fluorescenza si dividono principalmente in tre categorie: microscopi a fluorescenza diritti (adatti al sezionamento), microscopi a fluorescenza invertiti (adatti a cellule viventi, tenendo conto delle sezioni), microscopi stereoscopici a fluorescenza (adatti a campioni più grandi, come piante, pesci zebra (adulti/ embrione), medaka, organi di topo/ratto, ecc.).
Il blocco del filtro di fluorescenza è il componente principale dell'imaging a fluorescenza nei microscopi. È costituito da un filtro di eccitazione, un filtro di emissione e un divisore di fascio dicroico. È installato nella ruota portafiltri, come il Leica DMi8 dotato di ruota portafiltri 6-posizione (Figura 3). ). Microscopi diversi hanno posizioni delle ruote diverse e alcuni microscopi utilizzano vetrini portafiltri.
Il blocco del filtro svolge un ruolo importante nell'imaging a fluorescenza: il filtro di eccitazione seleziona la luce di eccitazione per eccitare il campione e blocca altre lunghezze d'onda della luce; la luce che passa attraverso il filtro di eccitazione passa attraverso un beamsplitter dicroico (il suo ruolo è riflettere la luce di eccitazione e trasmettere la fluorescenza), dopo la riflessione, viene focalizzata dalla lente dell'obiettivo, irradiata sul campione e la corrispondente fluorescenza viene eccitata per emettere luce. La luce emessa viene raccolta dalla lente dell'obiettivo, passa attraverso il divisore di fascio dicroico e raggiunge il filtro di emissione. Come mostrato nella Figura 4: la lunghezza d'onda di eccitazione è 450-490nm, il divisore di raggio dicroico riflette la luce più corta di 510nm, trasmette luce più lunga di 510nm e l'intervallo di ricezione della luce di emissione è 520-560nm.
I filtri per fluorescenza comunemente usati nei microscopi a fluorescenza possono essere suddivisi in due tipi: passa-lungo (LP per breve) e passa-banda (BP per breve). La banda passante è generalmente determinata dalla lunghezza d'onda centrale e dall'ampiezza dell'intervallo, ad esempio 480/40, il che significa che può essere fatta passare la luce da 460-500nm. I filtri passa-lungo, come 515 LP, lasciano passare la luce con lunghezze d'onda superiori a 515 nm (Figura 5).
Le sostanze fluorescenti hanno la loro caratteristica curva di eccitazione (assorbimento) e curva di emissione, il picco di eccitazione è la lunghezza d'onda di eccitazione ideale (elevata efficienza di eccitazione, che può ridurre l'energia della luce di eccitazione, proteggere cellule e coloranti) e la curva di emissione è la lunghezza d'onda della fluorescenza di emissione gamma. Pertanto, nell'esperimento, sceglieremo la lunghezza d'onda più vicina possibile al picco di eccitazione per l'eccitazione e l'intervallo di ricezione deve includere il picco di emissione. Ad esempio, il picco di eccitazione di Alexa Fluor 488 è di 500 nm e il filtro di eccitazione di 480/40 può essere selezionato nel microscopio a fluorescenza.
I dettagli dei cubi filtro possono essere visualizzati nel software di imaging del microscopio. Capire i coloranti e trovare il filtro che meglio si adatta al tuo campione è fondamentale per l'imaging in fluorescenza. Le informazioni spettrali dei coloranti fluorescenti e delle proteine fluorescenti sono generalmente indicate nelle istruzioni e possono essere trovate anche online.
Oltre alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione delle sonde fluorescenti, la selezione dei blocchi filtro deve anche considerare se esiste un'eccitazione non specifica e se esiste un colore incrociato per i campioni con etichetta multicolore. Inoltre, è necessario considerare la sorgente luminosa fluorescente utilizzata. Attualmente, le sorgenti luminose fluorescenti comunemente utilizzate includono lampade al mercurio, lampade ad alogenuri metallici e sorgenti luminose a LED che si sono sviluppate rapidamente negli ultimi anni. Lo spettro di una sorgente luminosa fluorescente è continuo o discontinuo e l'energia sarà diversa nelle diverse bande di lunghezza d'onda. La sorgente luminosa a LED sta gradualmente diventando la principale fonte di luce del microscopio a fluorescenza grazie alla sua banda spettrale relativamente stretta, all'emissione di energia più stabile, alla lunga durata, alla protezione più sicura e ambientale e a molti altri vantaggi.
Oltre al blocco filtro incorporato del microscopio, è presente anche una ruota rapida esterna (Figura 7). La velocità di conversione del filtro adiacente alla ruota veloce esterna di Leica è di 27 ms, che può realizzare esperimenti multicolore ad alta velocità, come l'imaging del calcio con rapporto FRET e Fura2. (Fig. 8) et al.
Un'ampia varietà di tecniche di imaging di microscopia a fluorescenza
Per soddisfare le diverse esigenze di imaging in fluorescenza, oltre ai microscopi a fluorescenza, sono state sviluppate varie soluzioni di imaging per microscopia a fluorescenza:
I sistemi di imaging ad alta definizione ad ampio campo, come Leica THUNDER Imager, utilizzano l'innovativa tecnologia Clearing di Leica per rimuovere in modo efficiente i segnali di interferenza del piano non focale durante l'imaging, presentando immagini nitide e i vantaggi dell'imaging ad alta velocità;
Il microscopio confocale a scansione laser utilizza fori stenopeici per eliminare le interferenze del piano non focale, realizza il sezionamento ottico e ottiene immagini ad alta definizione e immagini tridimensionali;
Microscopi e nanomicroscopi ad altissima risoluzione che superano il limite di diffrazione possono osservare strutture fini inferiori a 200 nm;
Un sistema di imaging multifotone che utilizza il principio dell'eccitazione multifotone per l'imaging di tessuti spessi e profondi in vivo;
Tecnologia di imaging a foglio leggero con elevata risoluzione temporale e spaziale, velocità di imaging rapida, alta risoluzione, bassa fototossicità, particolarmente adatta per la ricerca sullo sviluppo e l'osservazione dinamica in vivo;
L'imaging della durata della fluorescenza (FLIM), che non è influenzato da fattori come la concentrazione di sostanze fluorescenti, il fotosbiancamento, l'intensità della luce di eccitazione, ecc., può eseguire misurazioni funzionali e accurate più approfondite;
La spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) e la spettroscopia di correlazione incrociata di fluorescenza (FCCS), misurano il numero molecolare e il coefficiente di diffusione delle molecole fluorescenti, analizzando così la concentrazione molecolare, la dimensione molecolare, la viscosità, il movimento molecolare, il legame/dissociazione molecolare e le proprietà ottiche molecolari;
La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), con una risoluzione dell'asse z estremamente elevata, è ideale per studiare la struttura molecolare e la dinamica delle superfici delle membrane cellulari.
