La differenza tra contrasto di fase positivo e negativo in un microscopio
A seconda della configurazione e della natura dell'anello di fase posizionato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, i campioni possono essere osservati in contrasto di fase positivo o negativo. Questo tutorial interattivo studia la relazione tra surround (S), diffrazione (D) e particelle luminose risultanti (onde P), nonché microscopia a contrasto di fase positivo e negativo. Inoltre, vengono presentate anche la geometria della piastra di fase e immagini campione rappresentative.
Quando le persone lo usano ora nel loro lavoro, la maggior parte dei ricercatori si trova nella differenza negativa, e ora la differenza positiva non gioca molto ruolo nell'attuale lavoro di ricerca scientifica.
Il tutorial inizializza l'immagine di fase con un campione selezionato casualmente che appare nella finestra Phase Contrast Image e la relazione d'onda corrispondente viene mostrata nel vicino sinistro della finestra dell'immagine. Per utilizzare il tutorial, utilizzare il cursore del mouse per spostare la traslazione tra il contrasto di fase positivo e negativo o il cursore della modalità di contrasto di fase dell'illuminazione intensa. Quando il dispositivo di scorrimento viene traslato, le immagini che appaiono nella finestra dell'immagine a contrasto di fase cambiano l'aspetto del campione nella modalità di imaging corrente impostata dal dispositivo di scorrimento. Inoltre, sotto il grafico della forma d'onda è presente un piatto di fase che cambia forma per adattarsi alla modalità di imaging selezionata dal dispositivo di scorrimento. Per visualizzare un nuovo campione, utilizzare il menu a discesa Campione selezionato per selezionare un altro campione.
Un grafico della configurazione della piastra di fase, delle relazioni d'onda e dei vettori associati alla generazione di immagini di contrasto di fase positive e negative è presentato nella Figura 1. Vengono mostrati anche esempi di campioni ripresi da queste tecniche. In una configurazione ottica a contrasto di fase positivo (riga superiore dell'immagine nella Figura 1), il fronte d'onda surround (S) passa attraverso la piastra di fase, determinando uno sfasamento netto di 180 gradi di anticipo di fase, di 1/4 di lunghezza d'onda ( 1 mezza lunghezza d'onda). I fronti d'onda surround avanzati sono ora in grado di partecipare all'interferenza distruttiva con le onde diffratte (D) sul piano dell'immagine intermedio. Nella maggior parte dei casi, il semplice avanzamento della fase relativa del fronte d'onda circostante da solo non è sufficiente per generare immagini ad alto contrasto nei microscopi Nikon. Questo perché l'ampiezza delle onde surround è significativamente maggiore di quella delle onde diffratte e sopprime l'immagine risultante prodotta dall'interferenza da una frazione del numero totale di onde. Per ridurre il fronte d'onda circostante a un valore più vicino all'ampiezza delle onde diffratte (ed eseguire interferenze nel piano dell'immagine), l'opacità nell'anello di fase dell'obiettivo si ottiene applicando un metallo semitrasparente (densità crescente neutra ) rivestimento Pavimento. Le onde luminose circostanti, che per progettazione passano quasi completamente attraverso l'anello di fase, sotto la microscopia a contrasto di fase, sono significativamente ridotte in ampiezza dall'opacità del piatto di fase a un valore compreso tra il 10 e il 30 percento dell'intensità originale.
Poiché l'onda della particella risultante è prodotta dall'interferenza* dei fronti d'onda circostanti e diffratti, l'ampiezza dell'onda della particella (P) prodotta dall'interferenza tra i fronti d'onda che arrivano al piano dell'immagine è ora molto più piccola di quella circostante quando in Sexual rivestimento di densità applicato. L'effetto netto è quello di convertire la differenza di fase relativa introdotta dal passaggio della luce che emerge dal piano dell'immagine attraverso il campione in una differenza di ampiezza (intensità). Poiché l'occhio umano interpreterà la differenza di intensità come un contrasto, il campione è ora visibile nell'oculare del microscopio e può anche essere catturato sulla membrana con sistemi di fotocamere convenzionali o digitalmente, utilizzando dispositivi CCD o CMOS. Tutti i sistemi a contrasto di fase positivo fanno avanzare selettivamente la fase del fronte d'onda surround lineare (S) rispetto al fronte d'onda sferico diffratto (D). I campioni con un indice di rifrazione superiore rispetto al mezzo circostante appaiono più scuri su uno sfondo grigio neutro, mentre quelli con un indice di rifrazione inferiore rispetto al mezzo di nuoto appaiono più luminosi rispetto allo sfondo grigio.
Al fine di modificare la separazione spaziale dei fronti d'onda diffratti che circondano la fase e l'ampiezza in un sistema ottico a contrasto di fase, sono state introdotte numerose configurazioni del piatto di fase. Poiché il piatto di fase si trova in corrispondenza o molto vicino al piano focale posteriore dell'obiettivo (piano di diffrazione), tutta la luce che passa attraverso il microscopio deve passare attraverso questo componente. La parte del piatto di fase nel suo fuoco anulare condensatore è chiamata regione coniugata, mentre la regione rimanente è chiamata regione complementare. La regione coniugata contiene il materiale responsabile della modifica della fase della luce circostante (non diffratta) di più o meno 90 gradi rispetto al fronte d'onda diffratto. In generale, l'area dell'anello di fase coniugata è più ampia (circa il 25 percento) dell'area definita dall'immagine dell'anello di condensazione per ridurre la quantità di luce circostante che si propaga nell'area complementare.
La maggior parte delle lastre di fase disponibili presso i moderni produttori di microscopi sono quelle preparate mediante deposizione sotto vuoto di sottili pellicole dielettriche e metalliche su una lastra di vetro o montate direttamente sulla superficie della lente dell'obiettivo del microscopio. Il ruolo del film dielettrico è quello di mettere in fase la luce, mentre il film metallico attenua l'intensità della luce non diffratta. Alcuni produttori utilizzano più rivestimenti antiriflesso combinati con la pellicola per ridurre la quantità di abbagliamento e riflessione della luce parassita nel sistema ottico. Se il piatto di fase non è formato sulla superficie di una lente, di solito è cementato tra lenti successive che risiedono sul piano focale vicino alla parte posteriore dell'obiettivo. Lo spessore e l'indice di rifrazione dei rivestimenti dielettrici, metallici e antiriflesso, nonché quelli del cemento ottico, sono scelti con cura per produrre lo sfasamento desiderato tra le regioni complementari e coniugate della piastra di fase. In termini ottici, un piatto di fase che cambia la fase rispetto alla luce circostante per diffrangere la luce di 90 gradi (positivi o negativi) è chiamato piatto a quarto d'onda a causa dell'effetto di differenza del percorso ottico su di esso.
Una panoramica della fase positiva inversa è mostrata nella Figura 1. La piastra di contrasto della fase positiva (lato sinistro della Figura 1) spinge l'onda surround, di 1/4 della lunghezza d'onda, a causa dell'anello di erosione nella lastra di vetro, che può essere ridotto dal passaggio superiore nella piastra ad alto indice Il percorso fisico dell'onda preso. A causa dell'interazione con il campione, quando i raggi del campione diffratti (D) sono ritardati, la differenza del percorso ottico tra le onde circolanti e quelle diffratte che emergono dalla piastra di fase è di metà lunghezza d'onda per 1/4 di lunghezza d'onda. Il risultato netto è una differenza del percorso ottico di 180- gradi tra le onde circostanti e quelle diffratte, che si traduce in un'interferenza distruttiva per i campioni ad alto indice di rifrazione tra i piani dell'immagine. La curva di ampiezza per la fase positiva opposta all'onda di interferenza distruttiva è mostrata nel grafico superiore della Figura 1. L'onda particellare risultante (P) ha un'ampiezza inferiore rispetto all'onda surround (S), facendo così apparire l'oggetto rispetto a un oggetto relativamente sfondo più scuro. In basso, immagine dell'alga verde Zygnema mostrata a destra (etichettata DL). Il vettore rappresentato dall'andamento della lunghezza d'onda di 1/4, mostrato come un'onda surround rotante di 90-gradi in senso antiorario in contrasto di fase positivo, appare tra la figura e l'immagine nella Figura 1.
In alternativa, l'ottica del microscopio può anche essere fabbricata per produrre una fase negativa opposta, come mostrato nella parte inferiore della Figura 1, nel qual caso le onde surround (S) sono ritardate (piuttosto che avanzate) di un quarto di lunghezza d'onda rispetto a l'unica onda diffratta (D). Di conseguenza, i campioni con indici di rifrazione elevati appaiono più luminosi su uno sfondo grigio più scuro (vedere l'immagine inferiore etichettata BM nella Figura 1). Nella fase negativa opposta, la piastra di fase obiettivo contiene un anello rialzato che ritarda la fase (invece di far avanzare la fase come la fase positiva opposta), passando un quarto di lunghezza d'onda rispetto alla fase dell'onda diffratta come onda surround di ordine zero. Poiché le onde diffratte sono state ritardate di un quarto di lunghezza d'onda mentre passano attraverso il campione, la differenza del percorso ottico tra le onde circostanti e quelle diffratte viene eliminata e il campione ad alto indice di rifrazione interferisce in modo costruttivo sul piano dell'immagine. Si noti che l'onda particellare risultante (P) è più ampia in ampiezza rispetto all'onda surround (S) in contrasto di fase negativo. Viene anche mostrata un'inversione di fase negativa, in cui il vettore d'onda di circumnavigazione passa attraverso una rotazione di 90 gradi in senso orario del diagramma vettoriale.
