Caratteristiche tecniche e capacità d'uso del microscopio a fluorescenza a due fotoni
La microscopia a fluorescenza a due fotoni è una nuova tecnologia che combina la microscopia confocale a scansione laser e la tecnologia di eccitazione a due fotoni.
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è: nel caso di un'elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire due fotoni a lunghezza d'onda lunga contemporaneamente ed emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta dopo un breve periodo della cosiddetta durata dello stato eccitato . ; L'effetto è lo stesso che si ottiene usando un fotone con una lunghezza d'onda pari alla metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare una molecola fluorescente. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni. Per non danneggiare le cellule, la microscopia a due fotoni utilizza laser pulsati bloccati in modalità ad alta energia. Il laser emesso da questo laser ha un'energia di picco elevata e un'energia media bassa, la sua larghezza di impulso è di soli 100 femtosecondi e il suo periodo può raggiungere da 80 a 100 megahertz. Quando si utilizza una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni del laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione a due fotoni si verifica solo nel punto focale della lente dell'obiettivo, quindi il microscopio a due fotoni non necessita di un foro stenopeico confocale, il che migliora l'efficienza di rilevamento della fluorescenza. È un importante metodo di ricerca nei campi della morfologia, della biologia cellulare molecolare, delle neuroscienze e della farmacologia.
1. Lo sfondo dell'emergere della microscopia a due fotoni - due limiti della microscopia confocale laser tradizionale:
1) Uno è il fenomeno della fototossicità: poiché il foro stenopeico confocale deve essere abbastanza piccolo per ottenere un'immagine ad alta risoluzione, e la piccola apertura bloccherà gran parte della fluorescenza emessa dal campione, compresa la fluorescenza emessa dal piano focale, il corrispondente Sì, la luce di eccitazione deve essere abbastanza forte da ottenere un rapporto segnale/rumore sufficiente; e il laser ad alta intensità farà sbiadire rapidamente il colorante fluorescente durante la scansione continua e il segnale fluorescente diventerà sempre più debole man mano che la scansione procede.
2) La fototossicità è un altro problema. Sotto irradiazione laser, molte molecole di colorante fluorescente produrranno citotossine come ossigeno singoletto o radicali liberi, quindi il tempo di scansione e la densità di potenza ottica della luce di eccitazione dovrebbero essere limitati nell'esperimento per mantenere la densità del campione. attivo. Nella ricerca sui campioni attivi, in particolare i vari stadi di crescita e sviluppo dei campioni attivi, il fotosbiancamento e la fototossicità rendono questi studi molto limitati.
2. Perché dici che i microscopi a due fotoni generalmente non hanno bisogno di essere equipaggiati con laser ad eccitazione ultravioletta?
La microscopia a due fotoni è una tecnologia di eccitazione a fluorescenza basata sull'effetto di eccitazione a due fotoni: le molecole di colorante fluorescente possono essere eccitate assorbendo due fotoni a bassa energia contemporaneamente (l'intervallo di tempo tra due fotoni che raggiungono le molecole fluorescenti è inferiore a 1 femtosecondo ), il suo effetto di eccitazione può essere equivalente all'assorbimento di un fotone ad alta energia di 1/2 lunghezza d'onda. Ad esempio, l'assorbimento di due fotoni a lunghezze d'onda rosse equivale a una molecola che assorbe l'ultravioletto. I fotoni a lunghezza d'onda lunga non vengono assorbiti facilmente dalle cellule, quindi la fototossicità per le cellule viventi è ridotta e anche il fotosbiancamento è ridotto. In questo modo, non solo svolge la funzione di eccitazione ultravioletta, ma evita anche il danno della luce ultravioletta al campione.
3. Cos'ha di speciale il laser del microscopio a due fotoni?
La probabilità di assorbimento di due fotoni dipende da quanto strettamente coincidono i due fotoni incidenti nello spazio e nel tempo (i due fotoni devono arrivare entro 10-18 secondi). La sezione d'urto di assorbimento a due fotoni è piccola e solo i fluorofori nelle regioni con un grande flusso di fotoni sono eccitati. Pertanto, la maggior parte dei laser utilizzati sono laser allo zaffiro di titanio, che possono raggiungere velocità di scansione di picosecondi o femtosecondi e hanno una potenza di picco molto elevata e una potenza media bassa, in modo da ridurre o eliminare il fotosbiancamento e la fototossicità. La cosa più importante è fornire un'altissima densità di fotoni in un piccolo intervallo, che possa garantire l'eccitazione simultanea di due fotoni.
4. Quali sono i vantaggi dell'eccitazione a due fotoni?
1) Aumentare la selettività del colorante: l'intervallo della luce di eccitazione del laser del sistema confocale (Ar, Ar/Kr, HeNe) è di 488 nm - 647 nm. Ciò significa sperimentare coloranti fluorescenti eccitati dai raggi UV, ad esempio con DAPI , Hoescht. La lunghezza d'onda di eccitazione del doppio fotone è doppia rispetto a quella del singolo fotone, quindi i coloranti eccitati dall'ultravioletto possono essere eccitati dalla luce del vicino infrarosso.
2) Ridurre il fotosbiancamento: a causa della riduzione del fotosbiancamento, aumenta il tasso di successo degli esperimenti che utilizzano CFP/YFP per il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza (FRET).
3) Non è richiesta alcuna lente obiettivo speciale: dal punto di vista hardware, l'eccitazione dei coloranti eccitati dai raggi UV con la lunghezza d'onda della luce del vicino infrarosso non richiede componenti ottici UV speciali.
4) Migliorare il rapporto segnale-rumore: la lunghezza d'onda della luce di eccitazione e la lunghezza d'onda della luce emessa hanno una grande differenza, che migliora il rapporto segnale-rumore.
5) Sbiancamento localizzato al punto focale: poiché l'eccitazione della fluorescenza si verifica solo nel punto focale dell'obiettivo, non è necessario un foro stenopeico confocale. Ciò migliora il rilevamento della luce e il photobleaching si verifica solo nel punto focale.
6) Campioni più facili da penetrare: la luce a lunghezza d'onda infrarossa non è facilmente dispersa dalle cellule e può penetrare campioni più profondi.
5. Rispetto alla microscopia confocale a scansione laser, qual è il più grande miglioramento apportato dalla microscopia a due fotoni?
1) Fotosbiancamento ridotto.
2) Fototossicità ridotta.
3) Non è facile disperdere ed è più facile penetrare campioni spessi, come fette di cervello.
