Tecniche di colorazione e osservazione microscopica dei microrganismi
Colorazione semplice dei batteri
1 Obiettivi
1.1 Apprendere le tecniche di base dello striscio microbico e della colorazione.
1.2 Padroneggiare il semplice metodo di colorazione dei batteri.
1.3 Conoscere le caratteristiche morfologiche dei batteri e consolidare l'apprendimento dell'uso dello specchio ad olio e delle tecniche di funzionamento asettico.
2 Principio Lo striscio e la colorazione dei batteri sono una tecnica fondamentale negli esperimenti microbiologici. Le cellule dei batteri sono piccole e trasparenti, non sono facili da riconoscere al microscopio ottico comune e devono essere colorate. L'uso di un singolo colorante per colorare i batteri, in modo che l'organismo colorato e lo sfondo formino una chiara differenza di colore, in modo che la loro morfologia e struttura possano essere osservate più chiaramente. Questo metodo è di facile esecuzione ed è adatto all'osservazione della forma generale dell'organismo e della disposizione dei batteri. I coloranti alcalini sono comunemente usati per colorazioni semplici, perché in soluzioni neutre, alcaline o debolmente acide, le cellule batteriche sono solitamente caricate negativamente e quando i coloranti alcalini vengono ionizzati, la porzione colorante delle loro molecole è caricata positivamente, quindi la porzione colorante dei coloranti alcalini può facilmente legarsi ai batteri per renderli colorati. Le cellule batteriche colorate contrastano nettamente con lo sfondo e sono più facili da riconoscere al microscopio. I coloranti comunemente usati per la colorazione semplice includono il blu merocianina, il cristalvioletto e il rosso composto basico. Quando la decomposizione batterica dello zucchero produce acido in modo che il pH del mezzo diminuisca, la carica positiva dei batteri aumenta e quindi può essere utilizzata nella colorazione del rosso, del rosso acido o del rosso Congo e di altri coloranti acidi. I batteri devono essere fissati prima della colorazione. Il suo scopo è duplice: uno è uccidere i batteri e farli aderire al vetrino; il secondo è aumentare la sua affinità per il colorante. Vengono comunemente utilizzati due metodi: riscaldamento e fissazione chimica. Cercare di mantenere la morfologia originale delle cellule durante il fissaggio.
3 Materiali
3.1 Ceppo di Bacillus subtilis 12-18h coltura slant su agar nutriente, Staphylococcus aureus circa 24 ore coltura slant su agar nutriente, coltura slant su agar nutriente per Escherichia coli 24 ore, coltura slant su agar lievito di birra.
3.2 Colorazione Colorazione alcalina blu di metilene di Lue (o colorazione viola cristallino di ossalato di ammonio), colorazione rossa del composto di acido carbolico.
3.3 Strumenti o altro armamentario Microscopio, lampada ad alcool, vetrino, anello per inoculazione, portavetrini, bottiglia a doppio strato (riempita con olio di cedro e xilene), carta per microscopio, soluzione salina fisiologica o acqua distillata, ecc.
4 Procedura Striscio → asciugatura → fissazione → colorazione → lavaggio → asciugatura → esame microscopico.
5 passaggi
5.1 striscio Prelevare due vetrini puliti e privi di olio, ciascuno con una piccola goccia di soluzione salina (o acqua distillata) al centro del vetrino in condizioni asettiche, con un anello inoculante per operare asetticamente, rispettivamente, dal Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus ed Escherichia coli inclinati per raccogliere un po' di muschio nella goccia d'acqua, mescolarli e ricoprirli con una pellicola. Se lo striscio della sospensione batterica (o della coltura liquida), può essere utilizzato per inoculare 2 o 3 anelli direttamente sul vetrino. Tieni presente che la soluzione salina (acqua distillata) e i batteri non dovrebbero essere troppi e distribuiti uniformemente, non troppo spessi.
5.2 Asciugatura Asciugare naturalmente a temperatura ambiente. Può anche essere asciugato riscaldandolo leggermente sopra una lampada ad alcool con il lato rivestito rivolto verso l'alto. Non avvicinatevi però troppo alla fiamma, perché la temperatura troppo elevata distruggerebbe la morfologia dei batteri.
5.3 Fissazione Se si utilizza l'essiccazione termica, la fissazione e l'essiccazione vengono combinate in un'unica fase allo stesso modo dell'essiccazione. Spalmare, asciugare e fissare a caldo.
5.4 Colorazione Posizionare il vetrino in piano sul ripiano per vetrini, aggiungere 1 o 2 gocce di soluzione colorante sullo striscio (la soluzione colorante copre appena la pellicola dello striscio è appropriata). Colorare lo striscio con Basic Mellanox Blue di Lü per 1~2 minuti e con Carbonate Red (o Ammonium Oxalate Crystal Violet) per circa 1 minuto.
5.5 Risciacquo Eliminare la soluzione colorante e sciacquare delicatamente con acqua di rubinetto da un'estremità del vetrino fino a quando l'acqua che scorre dallo striscio diventa incolore. Durante il risciacquo non lasciare scorrere direttamente l'acqua per lavare la superficie rivestita. Il flusso d'acqua non deve essere troppo rapido o troppo abbondante per evitare di spostare il film di striscio.
5.6 Asciugatura Scuotere le gocce d'acqua sul vetrino per asciugarle naturalmente, asciugare con un asciugacapelli oppure utilizzare carta assorbente per asciugarle (fare attenzione a non rimuovere il corpo batterico). 5.7 Esame microscopico Lo striscio viene asciugato ed esaminato al microscopio. Lo striscio deve essere completamente asciutto prima di poter essere osservato con un microscopio ad olio.
6 Risultati Disegnare la morfologia di E. coli e Micrococcus garciniae dopo colorazione singola.
Colorazione di Gram
1. Scopo
1.1 Comprendere il principio della colorazione di Gram e la sua importanza nella classificazione e identificazione dei batteri.
1.2 Apprendere e padroneggiare la tecnica della colorazione di Gram e consolidare l'apprendimento dell'uso della lente ad olio del microscopio ottico.
