Requisiti per la preparazione dei campioni per la microscopia a fluorescenza

Requisiti per la preparazione dei campioni per la microscopia a fluorescenza

Requisiti per la preparazione del campione per la microscopia a fluorescenza

(1) Vetrino

Lo spessore del vetrino deve essere compreso tra 0.8-L2mm. Un vetrino troppo spesso assorbirà più luce da un lato e dall'altro non sarà in grado di focalizzare la luce di eccitazione sul preparato. I vetrini devono essere lisci, di spessore uniforme e privi di evidente autofluorescenza. A volte vengono utilizzati vetrini al quarzo.

(2) Vetro di copertura

Lo spessore del vetro di copertura è di circa 0,17 mm, liscio. Per potenziare la luce di eccitazione, si può utilizzare anche un vetrino coprioggetto di interferenza, che è uno speciale vetro coprioggetto rivestito con diversi strati di sostanze (come il fluoruro di magnesio) che hanno diversi effetti di interferenza sulla luce di diverse lunghezze d'onda, che possono rendere il fluorescenza liscia. La luce di eccitazione viene fatta passare e la luce di eccitazione viene riflessa e questa luce di eccitazione riflessa può eccitare il campione.

(3) Campione

Le fette di tessuto o altri campioni non devono essere troppo spesse. Se lo spessore è troppo spesso, la maggior parte della luce di eccitazione verrà consumata nella parte inferiore del campione, mentre la parte superiore direttamente osservata dalla lente dell'obiettivo non può essere completamente eccitata. Inoltre, la fluorescenza causata da cellule sovrapposte o impurità, la colorazione di fondo non specifica influisce sul giudizio.

(4) olio per specchi

Generalmente, quando si osservano campioni con microscopi a fluorescenza in campo oscuro e microscopi ad immersione in olio, è necessario utilizzare olio per immersione. È meglio usare uno speciale olio per immersione non fluorescente. Al suo posto è possibile utilizzare anche glicerina e paraffina liquida, ma l'indice di rifrazione è basso, il che ha un leggero impatto sulla qualità dell'immagine.

Comprensione del cubo di luce della microscopia a fluorescenza

La fluorescenza è la luce che gli elettroni in una sostanza assorbono l'energia luminosa da uno stato di bassa energia a uno stato di alta energia, e quindi rilasciano luce quando ritorna a uno stato di bassa energia. È luce non irradiata dalla temperatura: luminescenza. Cioè: la sostanza assorbe luce a onde corte, entra in uno stato eccitato ed emette luce a onde lunghe.

Che si tratti dell'autofluorescenza della sostanza, del colorante fluorescente o della proteina fluorescente espressa per fusione, deve essere eccitata da una specifica lunghezza d'onda della luce (eccitazione). Dopo che gli elettroni migrano e perdono energia, emettono luce di una specifica lunghezza d'onda lunga (Emissione). , che possono essere raccolti dal sistema di rilevamento per ottenere la funzione di identificazione della fluorescenza specifica.

Cos'è un cubo luminoso fluorescente?

Nell'osservazione e nell'imaging del microscopio a fluorescenza, la luce di eccitazione di lunghezza d'onda specifica e la corrispondente luce di emissione a lunghezza d'onda lunga sono fornite dal cubo luminoso di fluorescenza, in modo che il segnale di fluorescenza possa essere raccolto ad occhio nudo, schermo o fotocamera. Pertanto, il cubo di luce fluorescente determina ciò che può essere rilevato Il dispositivo chiave del segnale di fluorescenza, le sue caratteristiche includono EX: parametri del filtro della lunghezza d'onda di eccitazione, EM: parametri del filtro della lunghezza d'onda di emissione e DM: parametri dello specchio dicotomico. Prendiamo come esempio il cubo di luce DAPI del microscopio a fluorescenza integrato Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.

The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >La luce a 425 nm può essere trasmessa all'EM; I filtri di emissione EM vengono utilizzati per separare la fluorescenza emessa dal fluoroforo da altri elementi ottici di sfondo per separare la luce. I filtri di emissione trasmettono la luce alla lunghezza d'onda della fluorescenza attraverso lo specchio dicroico bloccando tutta l'altra luce che fuoriesce dalla sorgente luminosa di eccitazione (riflessa dal campione o dall'ottica). La lunghezza d'onda della luce emessa è maggiore di EM da osservare, ovvero solo la luce nell'intervallo di 450 ± 25 nm entra nel sistema di rilevamento. Una corretta selezione di dicotomie EX, filtri EM e DM può aiutare i ricercatori a ottenere rapporti segnale-rumore (S/N) più elevati.