Principi della microscopia laser confocale (LSCM)
Un microscopio confocale laser utilizza un foro stenopeico di illuminazione posizionato dietro la sorgente luminosa e un foro stenopeico di rilevamento posizionato davanti al rilevatore per ottenere l'illuminazione puntiforme e il rilevamento puntiforme. La luce proveniente dalla sorgente luminosa viene focalizzata su un punto nel piano focale del campione dalla luce emessa attraverso il foro stenopeico di illuminazione, e la fluorescenza emessa da quel punto viene ripresa all'interno del foro stenopeico di rilevamento e qualsiasi luce emessa all'esterno di quel punto viene bloccata dal foro stenopeico di rilevamento. foro stenopeico di rilevamento. Il foro stenopeico di illuminazione e il foro stenopeico di rilevamento sono coniugati per il punto illuminato o rilevato, in modo che il punto rilevato sia il punto confocale e il piano in cui si trova il punto rilevato è il piano confocale. Il computer visualizza il punto rilevato sullo schermo del computer sotto forma di punto immagine. Per produrre un'immagine completa, un sistema di scansione nel percorso ottico esegue la scansione del piano focale del campione, producendo così un'immagine confocale completa. Finché il piano portante viene spostato su e giù lungo l'asse Z, un nuovo livello del campione viene spostato sul piano confocale e il nuovo livello del campione viene visualizzato sul monitor, mentre l'asse Z continua a spostarsi. si muovono, si ottengono successive immagini tagliate di luce di diversi livelli del campione.
Il microscopio ottico tradizionale utilizza una sorgente luminosa di campo, l'immagine di ogni punto del campione sarà disturbata dalla diffrazione o diffusione della luce dai punti vicini; il microscopio confocale a scansione laser utilizza un raggio laser attraverso il foro stenopeico illuminato per formare una sorgente luminosa puntiforme sul campione scansionato in ciascun punto del piano focale interno, il campione sul punto irradiato, l'imaging del foro stenopeico di rilevamento, mediante il rilevamento del foro stenopeico dopo il punto del tubo di moltiplicazione della luce (PMT) o del dispositivo elettroaccoppiato a freddo (ccCD) ricevuto punto per punto o linea per linea, un'immagine fluorescente si forma rapidamente sullo schermo del monitor del computer. Il foro stenopeico di illuminazione e il foro stenopeico di rilevamento rispetto al piano focale della lente dell'obiettivo sono coniugati, il punto sul piano focale contemporaneamente focalizzato sul foro stenopeico di illuminazione e sul foro stenopeico di emissione, il punto esterno al piano focale non sarà nel rilevamento del foro stenopeico nell'imaging, in modo che l'immagine confocale ottenuta sia la sezione trasversale ottica del campione, superando le carenze dell'immagine sfocata del microscopio ordinario.
Dal principio di base, il microscopio confocale laser è un microscopio ottico moderno, è il microscopio ottico ordinario della tecnologia ad apportare i seguenti miglioramenti.
1. Utilizzare il laser come sorgente luminosa poiché la monocromaticità del laser è molto buona, la lunghezza d'onda del raggio della sorgente luminosa è la stessa, eliminando sostanzialmente l'aberrazione cromatica.
2. L'uso della tecnologia confocale nel piano focale della lente dell'obiettivo posta al centro con un piccolo foro nel deflettore, il piano focale all'esterno del blocco della luce diffusa, eliminando l'aberrazione sferica; ed eliminare ulteriormente l'aberrazione cromatica.
3. Microscopio confocale laser che utilizza la tecnologia di scansione puntiforme per scomporre il campione nello spazio bidimensionale o tridimensionale in innumerevoli punti, con un raggio laser molto piccolo (sorgente luminosa puntiforme) punto per punto, scansione di immagini linea per linea e quindi attraverso la combinazione microcomputer di un'intera immagine piana o tridimensionale. Il microscopio ottico tradizionale è una sorgente di luce di campo sotto l'imaging una tantum, i campioni su ciascun punto dell'immagine saranno adiacenti al punto di interferenza della luce diffratta e della luce diffusa. La chiarezza e la precisione di queste due immagini non possono essere paragonate.
4. Acquisizione ed elaborazione dei segnali ottici con un computer e amplificazione dei segnali con un tubo fotomoltiplicatore
Nel microscopio confocale laser, il computer sostituisce l'occhio umano o la fotocamera per l'osservazione e la registrazione video, e le immagini ottenute vengono digitalizzate e possono essere elaborate nel computer per migliorare nuovamente la chiarezza delle immagini. Inoltre, l'utilizzo di tubi fotomoltiplicatori può amplificare segnali molto deboli, migliorandone notevolmente la sensibilità. Come risultato dell'uso combinato delle tecnologie di cui sopra, si può dire che l'LSCM è il microscopio più avanzato al mondo. Si può dire che LSCM è la combinazione della tecnologia di produzione del microscopio, della tecnologia fotoelettrica e della tecnologia informatica **, è il prodotto inevitabile dello sviluppo della tecnologia moderna.
