Principi di microscopia a fluorescenza
I microscopi a fluorescenza sono diversi dai normali microscopi ottici. Invece di osservare i campioni sotto l'illuminazione di normali sorgenti luminose, usano la luce di una certa lunghezza d'onda (solitamente luce ultravioletta, luce blu-viola) per eccitare le sostanze fluorescenti nei campioni sotto il microscopio per farli emettere fluorescenza. Pertanto, la sorgente luminosa di un microscopio a fluorescenza non funziona come illuminazione diretta, ma come una fonte di energia che eccita le sostanze fluorescenti all'interno del campione. Il motivo per cui possiamo osservare il campione è dovuto all'illuminazione della sorgente luminosa, ma il fenomeno di fluorescenza presentato dopo che la sostanza fluorescente nel campione assorbe l'energia luminosa eccitata.
Si può vedere che la caratteristica del microscopio a fluorescenza è che la sua sorgente luminosa può fornire una grande quantità di luce di eccitazione in uno specifico intervallo di lunghezze d'onda, in modo che la sostanza fluorescente nel campione testato possa ottenere la luce di eccitazione dell'intensità necessaria. Allo stesso tempo, il microscopio a fluorescenza deve avere il sistema di filtri corrispondente.
La microscopia a fluorescenza è uno strumento essenziale nell'istochimica dell'immunofluorescenza. È composto da una sorgente luminosa ad altissima tensione, un sistema di filtri (compresa la piastra del filtro di eccitazione e soppressione), un sistema ottico e un sistema fotografico e altri componenti principali. Utilizza la luce di una certa lunghezza d'onda per eccitare il campione affinché emetta fluorescenza.
Il modo per eccitare la fluorescenza: in base alla gamma di lunghezze d'onda della luce, può essere suddivisa in due tipi: metodo di eccitazione UV (utilizzando il metodo di illuminazione ultravioletta) e metodo di eccitazione BV (utilizzando luce blu-violetta). Il metodo di eccitazione UV utilizza una luce quasi ultravioletta inferiore a 400 nm per l'eccitazione. Non c'è luce di eccitazione visibile in questo metodo, quindi la fluorescenza osservata presenta la fluorescenza intrinseca del colorante ed è facile distinguere la fluorescenza specifica sul campione dall'autofluorescenza del tessuto di fondo.
Il metodo di eccitazione BV si basa su 404nm e 434nm per l'eccitazione dalla luce ultravioletta alla luce blu. Questo metodo utilizza la luce blu per irradiare il campione, quindi il filtro di interruzione del sistema di osservazione della fluorescenza deve utilizzare un filtro in grado di bloccare completamente la luce blu e far passare completamente la fluorescenza verde e gialla richiesta. Coloranti fluorescenti per analisi anticorpali fluorescenti. La lunghezza d'onda massima di assorbimento della luce di eccitazione è relativamente vicina alla lunghezza d'onda massima di emissione della fluorescenza, quindi il filtro utilizzato nel metodo di eccitazione BV deve utilizzare un filtro di taglio netto. Questo metodo può utilizzare la luce blu come luce di eccitazione, quindi l'efficienza di assorbimento del pigmento fluorescente è maggiore e si può ottenere un'immagine più luminosa. Il suo svantaggio è che la fluorescenza al di sotto di 500 nm non può essere vista e la fluorescenza al di sopra di 500 nm fa apparire l'intera immagine gialla. Nel metodo dell'anticorpo fluorescente, la specificità del fluorocromo è spesso giudicata dal colore unico del fluorocromo. Pertanto, quando si discute di sottile specificità, le suddette carenze del metodo di eccitazione BV hanno spesso una grande influenza.
Per riassumere, l'illuminazione del microscopio a fluorescenza può essere considerata secondo i seguenti tre punti secondo la struttura del condensatore e la lunghezza d'onda della luce di eccitazione.
① Dal punto di vista dei requisiti di contrasto dell'immagine fluorescente, il concentratore di campo scuro di eccitazione UV viene utilizzato per l'illuminazione.
② Considerando la luminosità dell'immagine, il filtro di eccitazione BV ha la massima efficienza di osservazione del campo oscuro.
③Le caratteristiche dell'osservazione in campo oscuro del filtro di eccitazione UV e dell'illuminazione del concentratore in campo oscuro di eccitazione BV possono essere considerate tra questi due metodi di illuminazione, ma il primo ha proprietà di campo oscuro più forti e visualizza immagini più luminose. Il contrasto è piccolo; quest'ultimo mantiene le proprietà del percorso ottico del campo oscuro, quindi l'immagine visualizzata è più scura e il contrasto è migliorato. Quando si utilizza effettivamente un microscopio a fluorescenza, per l'osservazione dovrebbe essere utilizzato il metodo di illuminazione che meglio si adatta ai requisiti del campione.
Va sottolineato che anche se il condensatore di campo oscuro eccitato da UV con il miglior contrasto è illuminato, parte della luce di eccitazione ultravioletta rifratta o diffusa dal campione entrerà nella lente dell'obiettivo. L'autofluorescenza può peggiorare la risposta dell'immagine. Pertanto, un filtro che assorbe i raggi UV deve essere utilizzato davanti all'oculare come filtro cut-off.
