Principio e caratteristiche strutturali del microscopio a fluorescenza
Il microscopio a fluorescenza utilizza un punto con elevata efficienza luminosa per emettere luce con una determinata lunghezza d'onda (come luce ultravioletta 3650 o luce blu-viola 4200) attraverso il sistema di filtri colorati come luce di eccitazione, quindi eccita le sostanze fluorescenti nel campione affinché emettano fluorescenza con diversi colori, per poi osservarli attraverso l'amplificazione della lente dell'obiettivo e dell'oculare. In questo modo, sotto uno sfondo a forte contrasto, anche se la fluorescenza è molto debole, è facile da identificare e ha un'elevata sensibilità. Viene utilizzato principalmente per lo studio della struttura e della funzione cellulare e della composizione chimica. La struttura di base del microscopio a fluorescenza è composta da un normale microscopio ottico e da alcuni accessori (come sorgente luminosa fluorescente, filtro di eccitazione, divisore di fascio dicroico e filtro di blocco, ecc.). Sorgente luminosa fluorescente —— Viene generalmente utilizzata una lampada al mercurio ad altissima pressione (50-200 W), che può emettere luce con varie lunghezze d'onda, ma ciascuna sostanza fluorescente ha una lunghezza d'onda della luce di eccitazione che produce la fluorescenza più forte, quindi è È necessario aggiungere filtri di eccitazione (generalmente filtri di eccitazione ultravioletti, viola, blu e verdi), in modo che solo una certa lunghezza d'onda della luce di eccitazione venga trasmessa al campione e tutta la restante luce venga assorbita. Dopo che ciascuna sostanza è stata irradiata dalla luce di eccitazione, emette una fluorescenza visibile più lunga della lunghezza d'onda dell'irradiazione in un tempo molto breve. La fluorescenza ha specificità, che generalmente è più debole della luce di eccitazione. Per osservare la fluorescenza specifica è necessario bloccarla (o sopprimerla) dietro la lente dell'obiettivo e devono essere utilizzati insieme.
Differenza tra microscopio a fluorescenza e microscopio comune
1. La modalità di illuminazione è solitamente episodica, ovvero la sorgente luminosa viene proiettata sul campione attraverso la lente dell'obiettivo;
2. La sorgente luminosa è luce ultravioletta con lunghezza d'onda corta e risoluzione più elevata rispetto al normale microscopio;
3. Sono presenti due filtri speciali, quello davanti alla sorgente luminosa viene utilizzato per filtrare la luce visibile e quello tra l'oculare e la lente dell'obiettivo viene utilizzato per filtrare la luce ultravioletta per proteggere gli occhi delle persone.
Il microscopio a fluorescenza è anche un tipo di microscopio ottico, la differenza principale è che le loro lunghezze d'onda di eccitazione sono diverse. Ciò determina la differenza tra il microscopio a fluorescenza e il microscopio ottico ordinario nella struttura e nell'utilizzo.
Il microscopio a fluorescenza è lo strumento base della citochimica dell'immunofluorescenza. È composto da sorgente luminosa, sistema di piastre filtranti e sistema ottico. Utilizza la luce con una determinata lunghezza d'onda per eccitare il campione ed emette fluorescenza e la ingrandisce attraverso la lente dell'obiettivo e il sistema oculare per osservare l'immagine fluorescente del campione.
