Principio e costruzione del microscopio a fluorescenza
Il microscopio a fluorescenza utilizza una sorgente luminosa puntiforme ad alta efficienza luminosa, che emette una determinata lunghezza d'onda della luce (come la luce ultravioletta 3650 pollici o la luce blu viola 4200 pollici) attraverso un sistema di filtraggio del colore come luce di eccitazione ed eccita le sostanze fluorescenti nel campione per emettono vari colori di fluorescenza. Successivamente, viene osservato attraverso l'ingrandimento dell'obiettivo e dell'oculare. In questo modo, anche con una fluorescenza debole, è facilmente riconoscibile e altamente sensibile su sfondi a forte contrasto, utilizzato principalmente per studiare la struttura e la funzione cellulare, nonché la composizione chimica. La struttura di base di un microscopio a fluorescenza è composta da un normale microscopio ottico e da alcuni accessori (come una sorgente luminosa fluorescente, un filtro di eccitazione, un separatore di fascio bicromatico e un filtro di blocco, ecc.). Sorgenti luminose fluorescenti: solitamente utilizzano lampade al mercurio ad altissima pressione (50-200W), che possono emettere luce di varie lunghezze d'onda. Tuttavia, ciascuna sostanza fluorescente ha una lunghezza d'onda della luce di eccitazione che produce la fluorescenza più forte, quindi è necessario aggiungere filtri di eccitazione (solitamente filtri di eccitazione ultravioletti, viola, blu e verdi) per consentire solo a una determinata lunghezza d'onda della luce di eccitazione di passare attraverso e illuminare il campione, assorbendo tutta l'altra luce. Ogni sostanza, dopo essere stata irradiata dalla luce eccitata, emette in un periodo di tempo molto breve una fluorescenza visibile con una lunghezza d'onda maggiore dell'irradiazione. La fluorescenza ha specificità ed è generalmente più debole della luce di eccitazione. Per osservare la fluorescenza specifica, è necessario aggiungere un filtro bloccante (o soppressore) dietro la lente dell'obiettivo. Ha due funzioni: in primo luogo, assorbe e impedisce alla luce di eccitazione di entrare nell'oculare per evitare di disturbare la fluorescenza e di danneggiare gli occhi; in secondo luogo, seleziona e lascia passare la fluorescenza specifica, visualizzando un colore di fluorescenza specifico. Entrambi i tipi di filtri devono essere selezionati per essere utilizzati insieme.
Esistono due tipi di microscopi a fluorescenza in base al loro percorso ottico:
1. Microscopio a fluorescenza a trasmissione: la sorgente luminosa di eccitazione viene trasmessa attraverso il materiale del campione attraverso un condensatore per eccitare la fluorescenza. I collettori di luce in campo scuro comunemente usati, o i normali collettori di luce, possono essere utilizzati per regolare il riflettore per convertire la luce di eccitazione e la luce laterale sul campione. Questo è un microscopio a fluorescenza relativamente vecchio stile. Il suo vantaggio è che la fluorescenza è forte a basso ingrandimento, mentre lo svantaggio è che la fluorescenza si indebolisce all'aumentare dell'ingrandimento. Pertanto, è meglio osservare campioni di materiali più grandi.
2. Microscopio a fluorescenza a fascio cadente Si tratta di un nuovo tipo di microscopio a fluorescenza sviluppato nei tempi moderni. A differenza della precedente, la luce di eccitazione cade dalla lente dell'obiettivo sulla superficie del campione, utilizzando la stessa lente dell'obiettivo come condensatore di illuminazione e la lente dell'obiettivo per raccogliere la fluorescenza. È necessario aggiungere un separatore di fascio bicolore al percorso ottico, che si trova ad un angolo di 45 gradi rispetto all'uranio leggero. La luce di eccitazione viene riflessa nella lente dell'obiettivo e concentrata sul campione. La fluorescenza generata dal campione, così come la luce di eccitazione riflessa dalla superficie della lente dell'obiettivo e del vetro di copertura, entrano simultaneamente nella lente dell'obiettivo e ritornano al separatore di fascio dicroico, separando l'eccitazione e la fluorescenza. L'eccitazione residua viene quindi assorbita dal filtro di bloccaggio. Se vengono utilizzati diversi filtri di eccitazione/separatori di fasci a doppio colore/combinazioni di filtri di blocco, possono soddisfare le esigenze di diversi prodotti di reazione fluorescente. Il vantaggio di questo microscopio a fluorescenza è che l'illuminazione del campo visivo è uniforme, l'immagine è chiara e maggiore è l'ingrandimento, più forte è la fluorescenza.
