Preparazione e osservazione di campioni biologici per la microscopia elettronica
La risoluzione del microscopio dipende dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata, il microscopio elettronico cominciò ad apparire nel 1933 è dovuto all'uso di una lunghezza d'onda molto più corta della luce visibile del fascio di elettroni come sorgente luminosa, in modo che la risoluzione sia può ottenere che il microscopio ottico notevolmente sia migliorato. La diversa sorgente luminosa determina anche una serie di differenze tra il microscopio elettronico e il microscopio ottico.
In base alle differenze nel principio di imaging del fascio di elettroni e al ruolo del campione nei diversi modi, il moderno microscopio elettronico è stato sviluppato per formare una serie di tipi, attualmente * comunemente usati è il microscopio elettronico a trasmissione e quello elettronico a scansione microscopio, il primo può essere nell'intervallo di 1,000-1,000,000 volte l'ingrandimento totale dell'intervallo di modifiche, il secondo può essere nell'ingrandimento totale del { {4}},000 volte l'ingrandimento totale delle variazioni tra. Questo esperimento si concentra sulla preparazione di campioni per i due tipi di microscopi, microscopio elettronico a trasmissione e microscopio elettronico a scansione.
Materiali
1. Ceppo di Escherichia coli (Escherichia coli, Escherichia coli) inclinato.
2. Soluzioni o reagenti Acetato di amile, acido solforico concentrato, etanolo anidro, acqua sterile, soluzione acquosa di acido fosfotungstico di sodio al 2% (pH 6,5-8,0), 0,3% soluzione di polivinil formaldeide (sciolta in triclorometano), citocromo c, acetato di ammonio, plasmide pBR322.
3. Strumenti o altro armamentario Microscopio ottico comune, rete di rame, imbuto di porcellana, bicchiere, piatto piano, buretta sterile, pinzette sterili, lancetta, vetrini, ** piastra di conteggio, dispositivo di rivestimento sotto vuoto, essiccatore per punti critici e così via.
Fasi operative
(I) Preparazione del campione e osservazione al microscopio elettronico a trasmissione
1. Trattamento della rete metallica
I campioni per la microscopia ottica vengono posizionati su vetrini per l'osservazione. Tuttavia, nella microscopia elettronica a trasmissione, poiché gli elettroni non possono penetrare nella lastra di vetro, come supporto può essere utilizzato solo il materiale a rete, solitamente chiamato rete portante. La rete portante può essere suddivisa in molte specifiche diverse a causa dei diversi materiali e forme, di cui * comunemente usata è la rete di rame 200-400 mesh (numero di fori). La rete di rame deve essere trattata prima dell'uso per rimuovere lo sporco e mantenerla pulita, altrimenti ciò influenzerà la qualità della pellicola di supporto e la chiarezza delle foto dei campioni. La rete di rame utilizzata in questo esperimento è 400 mesh, che può essere trattata nel modo seguente: prima sbiancarla con acetato di amile per alcune ore, quindi sciacquarla con acqua distillata per diverse volte e infine sbiancarla in etanolo anidro per disidratazione. Se la rete di rame con il metodo sopra descritto non è ancora pulita, è possibile diluire l'acido solforico concentrato (1:1) immerso in 1 ~ 2 minuti o in una soluzione di NaOH all'1% bollita per diversi minuti, risciacquata più volte con acqua distillata , posto in disidratazione con etanolo anidro, da utilizzare.
2. Preparazione della pellicola di supporto
Nell'osservazione del campione, la rete portante deve essere ricoperta anche con uno strato di pellicola uniforme non strutturata, altrimenti piccoli campioni fuoriescono dai fori della rete portante; questo strato di pellicola è solitamente chiamato pellicola di supporto o pellicola portante. La pellicola di supporto dovrebbe essere trasparente agli elettroni e il suo spessore dovrebbe generalmente essere inferiore a 20 nm; sotto l'impatto del fascio di elettroni, il film dovrebbe anche avere un certo grado di resistenza meccanica, mantenere la stabilità della struttura e avere una buona conduttività termica; inoltre, la rete di supporto non dovrebbe avere alcuna struttura visibile al microscopio elettronico, non avere una reazione chimica con il campione trasportato e non interferire con l'osservazione del campione, e il suo spessore è generalmente di circa 15 nm. Il film di supporto può essere costituito da film plastico (es. film di cotone ignifugo, film di polietilene formaldeide, ecc.), film di carbonio o film metallico (es. film di berillio, ecc.). In condizioni di lavoro di routine, i requisiti possono essere soddisfatti con una pellicola di plastica, mentre la preparazione della pellicola di plastica nella pellicola adesiva di cotone ignifugo è relativamente semplice, ma la resistenza non è forte quanto la pellicola di polietilene formaldeide.
