Metodi per estendere la profondità focale dei microscopi multifotonici
La combinazione del microscopio a scansione laser a due-fotoni e dell'indicatore di calcio è il gold standard per il rilevamento del segnale neuronale in vivo. I neuroni nelle reti neurali sono distribuiti nello spazio tridimensionale e il monitoraggio delle loro dinamiche di attività richiede un modo per migliorare rapidamente la velocità di imaging del volume. Tuttavia, utilizzando un microscopio multifotone a scansione a reticolo per acquisire un gran numero di immagini, se si utilizza un obiettivo con apertura numerica elevata (NA) per ottenere una risoluzione laterale più elevata, si otterrà una profondità focale inferiore. Per ottenere l'imaging volumetrico a una profondità focale ridotta,
È necessario eseguire la scansione dell'asse Z- in qualche modo, immaginando molti piani scansionando ciascun piano focale, il che limita notevolmente la velocità di imaging. Se le informazioni sull'immagine assiale possono essere sacrificate e la scansione del volume può essere ottenuta in una scansione laterale estendendo la profondità di fuoco, ovvero le informazioni sul volume vengono proiettate su una singola immagine 2D, la velocità dell'immagine può essere notevolmente migliorata. Questo si chiama imaging EDF (Extended Depth of Focus), che è particolarmente utile per l'imaging di strutture di popolazione sparse che richiedono un'elevata risoluzione temporale, come l'imaging funzionale dell'attività neuronale.
Le risoluzioni assiale e laterale di un microscopio sono determinate dall'apertura numerica (NA) della lente dell'obiettivo. Un'elevata NA può massimizzare la risoluzione assiale e laterale nonché la quantità di luce raccolta; Una NA inferiore si tradurrà in una risoluzione assiale inferiore, ovvero una maggiore profondità di fuoco, ma allo stesso tempo sacrificherà la risoluzione laterale e l'efficienza di raccolta della luce. Il metodo per estendere la profondità di fuoco che verrà introdotto successivamente può raggiungere questo obiettivo mantenendo un'elevata risoluzione laterale e un flusso luminoso sufficiente.
L'uso di modulatori di luce spaziale per generare fasci Bessel sottili focali può ottenere l'imaging EDF, ma i modulatori di luce spaziale sono ingombranti e difficili da essere compatibili con spazi ristretti del microscopio; Al contrario, i moduli Bessel basati su piramidi assiali sono economici e compatti, ma possono generare solo punti focali di profondità fissa e non sono adatti a vari esperimenti che richiedono continui cambiamenti di profondità focale. Per affrontare questo problema, nel 2018, RONGWEN LU et al. ha dimostrato un modulo Bessel basato su un axicon, in cui è necessario traslare solo una lente lungo l'asse ottico per regolare continuamente la lunghezza assiale del punto focale di Bessel.
Figura 1 (a) Schema del dispositivo del modulo Bessel; (b) La funzione di diffusione dei punti è stata misurata sperimentalmente quando D era rispettivamente -12 mm, 0 mm e 12 mm; (c) La relazione tra l'intera larghezza laterale a metà massimo, (d) l'intera larghezza assiale a metà massimo, (e) segnale di picco e (f) potenza ottica dietro la lente dell'obiettivo con spostamento L2 D
Il dispositivo del modulo per formare un punto focale di Bessel a lunghezza variabile è mostrato nella Figura 1a. Il fascio gaussiano incidente assume la forma di un fascio circolare dopo essere passato attraverso un axicon e una lente L1. La successiva maschera di apertura circolare può bloccare la luce diffusa causata da difetti dell'assicone, modellando così la distribuzione assiale della funzione di diffusione del punto di eccitazione dei due fotoni. Successivamente, il fascio luminoso viene proiettato sul galvanometro dalle lenti L2 e L3, per poi raggiungere il piano focale posteriore della lente dell'obiettivo attraverso le lenti L4 e L5.
Questi design sono simili ai tradizionali moduli piramidali, con la differenza che spostando L2 o L3 lungo l'asse ottico, la lunghezza assiale del fuoco di Bessel può essere regolata continuamente. La Figura 1b mostra le funzioni di diffusione dei punti assiali per valori D di -12 mm, 0 mm e 12 mm, con larghezza assiale completa a metà massimo di 39? m,24? M e 14? M. Come mostrato nella Figura 1c-f, spostando la lente L2 da sinistra a destra è possibile modificare continuamente l'intera larghezza a metà massimo in entrambe le direzioni trasversale e assiale, il che significa che la profondità di messa a fuoco può essere modificata continuamente. I risultati della simulazione numerica basata sulla teoria della diffrazione vettoriale sono in buon accordo con i dati sperimentali. La Figura 2 verifica l'effetto di correzione di diverse dimensioni di maschere anulari sui difetti dell'axicon. Si è scoperto che maschere anulari più sottili possono ottimizzare meglio la distribuzione dell’intensità assiale del fascio di Bessel in uscita, ma allo stesso tempo portano anche a una maggiore perdita di potenza.
