Microscopio a fluorescenza e campo chiaro a basso costo
In questa guida esaminerò i principi di base della microscopia a fluorescenza e come costruire tre diversi microscopi a fluorescenza a basso costo. Questi sistemi in genere costano migliaia di dollari, ma i recenti sforzi li hanno resi più facili da ottenere. Il design che sto presentando qui utilizza smartphone, dSLR e microscopi USB. Tutti questi modelli possono essere utilizzati anche come microscopi a campo aperto.
Passaggio 1: panoramica della microscopia a fluorescenza
Per comprendere i concetti di base della microscopia a fluorescenza, immagina le fitte foreste, gli alberi, gli animali, gli arbusti e le altre foreste che vivono nella foresta di notte. Se punti una torcia nella foresta, vedrai tutte queste strutture ed è difficile immaginare animali o piante specifici. Supponendo che tu sia interessato solo a vedere gli arbusti di mirtilli nella foresta. Per raggiungere questo obiettivo, devi addestrare le lucciole a essere attratte solo dai cespugli di mirtilli, in modo che quando guardi la foresta, si illumineranno solo i cespugli di mirtilli. Puoi dire di aver contrassegnato i cespugli di mirtilli con le lucciole, in modo da poter vedere le strutture di mirtilli nella foresta.
In questa analogia, la foresta rappresenta l'intero campione, l'arbusto di mirtillo rappresenta la struttura che si desidera visualizzare (come cellule specifiche o organelli subcellulari) e le lucciole sono composti fluorescenti. La situazione in cui si scatta con una sola torcia senza lucciole è simile a quella con un microscopio a campo chiaro.
Il passo successivo è comprendere le funzioni di base dei composti fluorescenti (noti anche come fluorofori). I cluster fluorescenti sono in realtà piccoli oggetti (nanoscala) progettati per collegare strutture specifiche nel campione. Assorbono la luce di una gamma ristretta di lunghezze d'onda e riemettono la luce di un'altra lunghezza d'onda. Ad esempio, un gruppo fluorescente può assorbire la luce blu (cioè il gruppo fluorescente viene eccitato dalla luce blu) e poi emettere nuovamente luce verde. Di solito, questo è riassunto attraverso gli spettri di eccitazione e di emissione (come mostrato nella figura sopra). Questi grafici mostrano le lunghezze d'onda della luce assorbita dal fluoroforo e le lunghezze d'onda della luce emessa dal fluoroforo.
Il design del microscopio è molto simile a quello di un normale microscopio a campo aperto, con due differenze principali. Innanzitutto, la luce che illumina il campione deve essere alla lunghezza d'onda del gruppo fluorescente eccitato (nell'esempio sopra, la luce è blu). In secondo luogo, il microscopio deve solo raccogliere la luce emessa (luce verde) bloccando la luce blu. Questo perché la luce blu è ovunque, ma la luce verde proviene solo da strutture specifiche del campione. Per bloccare la luce blu, i microscopi di solito hanno qualcosa chiamato filtro passa lungo che consente alla luce verde di passare senza luce blu. Ciascun filtro passa lungo ha una lunghezza d'onda di taglio. Se la lunghezza d'onda della luce è maggiore della lunghezza d'onda di taglio, può passare attraverso un filtro. Pertanto, il nome è "Pass a lunga percorrenza". Le lunghezze d'onda più corte vengono bloccate.
Passaggio 2: modellazione di un microscopio utilizzando l'ottica ottica
Questo è un ulteriore passo nella progettazione del principio di base di un microscopio. Non è necessario costruire un microscopio a fluorescenza, quindi se non vuoi approfondire l'ottica, puoi saltarlo.
Sia i microscopi a campo chiaro che quelli a fluorescenza possono essere modellati utilizzando dispositivi ottici a raggi. La premessa di base dell'ottica a raggi è che il comportamento della luce è simile a quello della luce che si propaga lontano da una sorgente luminosa. Quando ti guardi intorno nella stanza, vedrai la luce del sole fuori dalla finestra o la luce portata dalla lampadina. Quindi la luce viene assorbita o riflessa dagli oggetti nella stanza. Un po' di luce riflessa lo farà guardare verso i tuoi occhi. Se un oggetto è illuminato, puoi immaginare che ogni punto dell'oggetto emetta luce in tutte le direzioni (come mostrato nell'immagine sopra). La lente, come la lente dei nostri occhi, focalizza la luce in un punto in modo che possiamo vedere l'oggetto. Senza lente, la luce continua a propagarsi verso l'esterno e non forma un'immagine.
