Miglioramenti dei vantaggi della microscopia multifotone a scansione laser
Il microscopio multifotone a scansione laser rappresenta un notevole miglioramento nella microscopia ottica, principalmente nella capacità di osservare la struttura profonda di cellule e tessuti viventi e fissati e di ottenere strutture Z-plane multistrato chiare e nitide, ovvero fette ottiche, da cui è possibile costruire una struttura solida tridimensionale del campione. La microscopia confocale utilizza una sorgente di luce laser che viene espansa per riempire l'intero piano focale posteriore della lente dell'obiettivo, quindi passa attraverso il sistema di lenti della lente dell'obiettivo per convergere in punti molto piccoli sul piano focale del campione. A seconda dell'apertura numerica della lente dell'obiettivo, la dimensione del diametro del punto luminoso è di circa 0,25 ~ 0,8 μm e la profondità è di circa 0,5 ~ 1,5 µm. La dimensione del punto confocale è determinata dal design del microscopio, dalla lunghezza d'onda del laser, dalle caratteristiche della lente dell'obiettivo, dall'impostazione dello stato dell'unità di scansione e dalla natura del campione. I microscopi da campo hanno un ampio intervallo di illuminazione e profondità di illuminazione, mentre i microscopi confocali concentrano l'illuminazione su un singolo punto focale sul piano focale. Il vantaggio più fondamentale di un microscopio confocale è la capacità di realizzare sezioni ottiche fini di campioni fluorescenti spessi (fino a 50 μm o più), con spessori di sezione compresi tra circa 0,5 e 1,5 μm. È possibile ottenere una serie di immagini di sezioni ottiche spostando il campione su e giù con il motore passo-passo dell'asse Z del microscopio. L'acquisizione delle informazioni sull'immagine è controllata nel primo piano e non è disturbata da segnali emessi da altre posizioni sul campione. Dopo aver rimosso gli effetti della fluorescenza di fondo e aumentato il rapporto segnale-rumore, il contrasto e la risoluzione dell'immagine confocale risultano significativamente migliorati rispetto alle tradizionali immagini a fluorescenza illuminate sul campo. In molti esemplari, molti componenti strutturali intricati si intrecciano per formare sistemi complessi, ma una volta acquisite sezioni ottiche sufficienti, possiamo ricostruirle in tre dimensioni utilizzando il software. Questo metodo sperimentale è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biologica per chiarire le complesse relazioni strutturali e funzionali tra cellule o tessuti.
