Conoscenze relative alla microscopia confocale a fluorescenza
Il principio di base della microscopia confocale a fluorescenza è quello di utilizzare una sorgente luminosa puntiforme per irradiare il campione, formando una piccola macchia ben definita sul piano focale. La fluorescenza emessa dallo spot dopo l'irradiazione viene raccolta dalla lente dell'obiettivo e rimandata allo spettrofotometro composto da uno specchio colorato bidirezionale lungo il percorso di irradiazione originario. Lo spettrofotometro invia la fluorescenza direttamente al rilevatore. Davanti alla sorgente luminosa e al rilevatore sono presenti due fori stenopeici, chiamati rispettivamente fori stenopeici di illuminazione e fori stenopeici di rilevamento. Le dimensioni geometriche dei due sono coerenti, circa 100-200nm; Rispetto al punto luminoso sul piano focale, i due sono coniugati, il che significa che il punto luminoso passa attraverso una serie di lenti e alla fine può concentrarsi contemporaneamente sia sul foro stenopeico di illuminazione che su quello stenopeico di rilevamento. In questo modo, la luce proveniente dal piano focale può convergere all'interno del campo del foro di rilevamento, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata all'esterno del foro di rilevamento e non può essere ripresa. Scansionando punto per punto il campione con un laser, il tubo fotomoltiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene punto per punto anche la corrispondente immagine confocale del punto luminoso, che viene convertita in un segnale digitale e trasmessa al computer. Infine, sullo schermo viene sintetizzata un'immagine confocale chiara dell'intero piano focale.
Ogni immagine del piano focale è in realtà una sezione trasversale ottica del campione, che ha sempre un certo spessore, noto anche come sezione ottica sottile. A causa del fatto che l'intensità della luce nel punto focale è molto maggiore di quella nel punto non focale, e la luce sul piano non focale è filtrata da fori stenopeici, la profondità di campo del sistema confocale è approssimativamente zero. La scansione lungo la direzione dell'asse Z può ottenere la tomografia ottica, formando una fetta ottica bidimensionale nel punto focale del campione osservato. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), è possibile ottenere un'immagine tridimensionale del campione accumulando strati continui di immagini bidimensionali ed elaborandole con un software informatico specializzato.
Il foro stenopeico di rilevamento e quello della sorgente luminosa sono sempre focalizzati sullo stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata all'esterno del piano di messa a fuoco non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
La semplice espressione del principio di funzionamento della microscopia confocale laser è che utilizza un laser come sorgente luminosa e aggiunge un dispositivo di scansione laser e un dispositivo di messa a fuoco coniugato sulla base dell'imaging tradizionale della microscopia a fluorescenza. È un sistema controllato da un computer per l'acquisizione e l'elaborazione di immagini digitali.
