Introduzione alla microscopia a fluorescenza
La microscopia a fluorescenza consiste nell'irradiare l'oggetto colorato con fluoresceina con luce a lunghezza d'onda corta, in modo che sia eccitato per produrre fluorescenza a lunghezza d'onda lunga e quindi osservato. In un microscopio a fluorescenza, la luce di eccitazione di una lunghezza d'onda specifica deve essere selezionata dalla luce di illuminazione del campione per generare la fluorescenza, quindi la fluorescenza deve essere separata dalla luce mista della luce di eccitazione e della fluorescenza per l'osservazione. Pertanto, il sistema di filtri svolge un ruolo estremamente importante nella selezione di una specifica lunghezza d'onda. I microscopi a fluorescenza sono ampiamente utilizzati in biologia, medicina e altri campi.
1. I componenti principali del microscopio a fluorescenza:
(A) Sorgente luminosa: la sorgente luminosa irradia luce di varie lunghezze d'onda (dall'ultravioletto all'infrarosso). IL
(B) Sorgente luminosa del filtro di eccitazione: attraverso la luce di una lunghezza d'onda specifica che può indurre il campione a produrre fluorescenza, bloccando la luce che è inutile per eccitare la fluorescenza. IL
(C) Campioni fluorescenti: generalmente colorati con pigmenti fluorescenti. IL
(D) Filtro di blocco: blocca la luce di eccitazione che non viene assorbita dal campione e trasmette selettivamente la fluorescenza, e alcune lunghezze d'onda vengono trasmesse selettivamente nella fluorescenza.
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2. Classificazione dei microscopi a fluorescenza:
I microscopi a fluorescenza sono generalmente divisi in due tipi: trasmissione ed epi-emissione:
UN. Tipo di trasmissione: la luce di eccitazione proviene dal fondo dell'oggetto da ispezionare e il condensatore è un condensatore di campo oscuro, in modo che la luce di eccitazione non entri nella lente dell'obiettivo, ma la fluorescenza entri nella lente dell'obiettivo. È luminoso a bassi ingrandimenti, ma scuro ad alti ingrandimenti. È difficile operare in immersione in olio e centraggio. È particolarmente difficile determinare la gamma di illuminazione a bassi ingrandimenti, ma può ottenere uno sfondo del campo visivo molto scuro. Il tipo di trasmissione non viene utilizzato per oggetti non trasparenti. IL
B. Epi-tipo: il tipo di trasmissione è attualmente quasi eliminato. La maggior parte dei nuovi microscopi a fluorescenza sono di tipo epi. La sorgente luminosa proviene dall'alto dell'oggetto da ispezionare e nel percorso ottico è presente un divisore di raggio, quindi è adatto sia per oggetti trasparenti che opachi da ispezionare. Poiché la lente dell'obiettivo funge da lente condensatrice, non solo è facile da usare, ma può anche ottenere un'illuminazione uniforme dell'intero campo visivo da un ingrandimento basso a un ingrandimento elevato. IL
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3. Precauzioni per la fluoroscopia
UN. L'irradiazione a lungo termine della luce di eccitazione causerà l'attenuazione e l'estinzione della fluorescenza, quindi accorciare il più possibile il tempo di osservazione e utilizzare un deflettore per coprire la luce di eccitazione quando non si osserva temporaneamente. IL
B. Quando si osserva con una lente per immersione in olio, utilizzare "olio non fluorescente". IL
C. La fluorescenza è quasi sempre debole e dovrebbe essere eseguita in una stanza buia. IL
D. È meglio installare uno stabilizzatore di tensione nell'alimentatore, altrimenti la tensione instabile non solo ridurrà la durata della lampada al mercurio, ma influenzerà anche l'effetto dell'ispezione del microscopio. IL
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4. Uso della microscopia a fluorescenza
1. Requisiti di preparazione per i campioni del microscopio a fluorescenza
UN. Scivolo in vetro
Lo spessore del vetrino deve essere compreso tra 0,8 e 1,2 mm. Un vetrino troppo spesso assorbe più luce da un lato e dall'altro la luce di eccitazione non può essere concentrata sul campione. I vetrini devono essere lisci, di spessore uniforme e privi di evidente autofluorescenza. A volte vengono utilizzati vetrini al quarzo. IL
B. Vetro di copertura
Lo spessore del vetro di copertura è di circa 0,17 mm, liscio. Per potenziare la luce di eccitazione si può utilizzare anche un dry cover glass, che è uno speciale vetrino coprioggetto rivestito con diversi strati di sostanze (come il fluoruro di magnesio) che hanno diversi effetti di interferenza sulla luce di diverse lunghezze d'onda, che possono rendere il fluorescenza andare senza intoppi. La luce di eccitazione viene fatta passare e la luce di eccitazione riflessa eccita il campione. IL
C. Campione
Le fette di tessuto o altri campioni non devono essere troppo spesse. Se è troppo spessa, la maggior parte della luce di eccitazione verrà consumata nella parte inferiore del campione, mentre la parte superiore osservata direttamente dalla lente dell'obiettivo non può essere completamente eccitata. Inoltre, la sovrapposizione cellulare o le impurità si nascondono, influenzando il giudizio. IL
D. Agente di montaggio
La glicerina è comunemente usata come agente di montaggio, che non deve avere autofluorescenza, incolore e trasparente, e la luminosità della fluorescenza è più luminosa a pH 8.5-9.5, e non è facile svanire rapidamente. Pertanto, una miscela uguale di glicerolo e 0.5mol/L di soluzione tampone di carbonato con un pH compreso tra 9.0 e 9.5 viene comunemente utilizzata come agente di montaggio. IL
e. olio per specchi
Generalmente, l'olio da immersione deve essere utilizzato quando si osservano campioni con microscopi a fluorescenza in campo oscuro e obiettivi per immersione a immersione in olio. È preferibile utilizzare uno speciale olio per specchi non fluorescente, che può anche essere sostituito dalla suddetta glicerina, e si può utilizzare anche la paraffina liquida, ma l'indice di rifrazione è basso, il che influisce leggermente sulla qualità dell'immagine.
