Metodi di imaging del campo-chiaro e del campo-scuro nella microscopia a fluorescenza
(1) Metodo di imaging in campo chiaro (BFI), che consente solo al fascio di elettroni trasmesso nella regione parassiale di passare attraverso l'apertura dell'obiettivo, formando un'immagine scura su uno sfondo luminoso. Minore è l'apertura dell'obiettivo, maggiore è il contrasto dell'immagine in campo chiaro; (2) L'imaging in campo oscuro (DFI) è una tecnica che consente solo a una porzione del raggio diffuso ad ampio angolo o a un determinato raggio di diffrazione del cristallo di passare attraverso l'apertura dell'obiettivo, bloccando al contempo il raggio trasmesso. Ciò forma un'immagine grafica luminosa su uno sfondo scuro. Questo metodo di imaging in campo scuro può migliorare il contrasto delle immagini ed è un'importante tecnica di imaging.
Esistono circa quattro metodi per ottenere immagini in campo scuro utilizzando i microscopi a fluorescenza Leica: (1) mantenere l'illuminazione verticale lungo l'asse ottico spostando l'apertura dell'obiettivo; (2) L'uso dell'illuminazione obliqua per catturare raggi sparsi nella direzione dell'asse ottico è chiamato Central Dark Field Imaging (CDFI); (3) Un'apertura dell'obiettivo con un arresto del raggio centrale e un'area trasparente circolare; (4) Utilizzare una lente condensatrice circolare trasparente per il rilevamento della luce e un'apertura circolare centrale per la lente dell'obiettivo. Il metodo * qui è il più semplice, ma utilizza l'imaging elettronico nell'area del manicotto distale, quindi l'aberrazione è ampia e la qualità dell'immagine non è molto buona. Il secondo metodo può evitare gli inconvenienti di cui sopra, ma l'apertura dell'obiettivo del microscopio a fluorescenza Leica riceve solo una piccola porzione di elettroni diffratti sparsi, con conseguente efficienza inferiore. Il lato dell'apertura è spesso soggetto a una grande quantità di bombardamento elettronico, che può facilmente causare contaminazione asimmetrica e influire sulla qualità dell'immagine. La lente dell'obiettivo anulare è stata migliorata sotto questo aspetto, ma lo svantaggio è che è difficile da produrre ed è difficile ottenere la completa simmetria assiale. Considerati i requisiti relativamente rilassati per il sistema di illuminazione, è possibile adottare quest'ultima soluzione, che prevede l'aggiunta di un'apertura anulare in corrispondenza del condensatore per fornire un'illuminazione a fascio cavo per il campione. L'effetto di questo dispositivo. La risoluzione dell'immagine può essere vicina a quella delle immagini in campo chiaro, mentre il contrasto è notevolmente migliorato.
