Come scegliere il microscopio a fluorescenza appropriato
Il microscopio a fluorescenza è un'apparecchiatura di imaging microscopico standard nei laboratori e nei dipartimenti di patologia, che utilizza le caratteristiche della fluorescenza per l'osservazione e l'imaging. È ampiamente utilizzato in vari campi come biologia cellulare, neurobiologia, botanica, microbiologia, patologia, genetica, ecc. L'imaging a fluorescenza presenta i vantaggi di un'elevata sensibilità e specificità, che lo rendono molto adatto per osservare la distribuzione di proteine, organelli, ecc. specifici . nei tessuti e nelle cellule, studiando la colocalizzazione e le interazioni, monitorando i processi dinamici della vita come i cambiamenti nella concentrazione di ioni e così via.
Selezione di microscopi
I microscopi a fluorescenza si dividono principalmente in tre categorie: microscopi a fluorescenza diritti (adatti per affettare), microscopi a fluorescenza invertiti (adatti per cellule vive e anche per affettare) e microscopi a stereofluorescenza (adatti per campioni più grandi, come piante, pesci zebra (adulti/ embrionale), medaka, organi di topo/ratto, ecc.).
Selezione di blocchi filtro fluorescenti
La selezione dei blocchi filtro non dovrebbe considerare solo le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione delle sonde fluorescenti, ma anche l'eventuale presenza di eccitazione non specifica e la presenza di diafonia cromatica per i campioni etichettati multicolore. Nell'esperimento, sceglieremo la lunghezza d'onda più vicina possibile al picco di eccitazione per l'eccitazione e l'intervallo di ricezione dovrebbe includere l'emissione di picco. Il picco di eccitazione di Alexa Fluor 488 è 500 nm e in un microscopio a fluorescenza è possibile selezionare un filtro di eccitazione 480/40. I blocchi di filtri fluorescenti comunemente utilizzati nella microscopia a fluorescenza possono essere suddivisi in due tipi: passa lungo (LP) e passa banda (BP), anch'essi devono essere selezionati in base alle esigenze.
Microscopio confocale
Nelle tradizionali osservazioni al microscopio a fluorescenza, a causa della sovrapposizione di sostanze marcate con fluorescenza e strutture di fluorescenza spontanea, queste sono strettamente legate insieme. Tuttavia, i tradizionali obiettivi per microscopia a fluorescenza a caduta non solo raccolgono la luce dal piano focale, ma diffondono anche la luce su e giù per il piano focale, determinando una significativa riduzione della risoluzione e del contrasto dell'immagine.
L'imaging confocale rileva solo la luce riflessa dal piano di autofocalizzazione, risolvendo così il problema di cui sopra. La sorgente luminosa forma un punto piccolo e sottile sul piano focale attraverso un foro stenopeico e la luce emessa dal piano focale viene raccolta attraverso la lente dell'obiettivo. La maggior parte della fluorescenza emessa dai punti sopra o sotto il piano focale della lente dell'obiettivo non può convergere verso il foro stenopeico. Solo la fluorescenza situata nel piano focale e una piccola porzione di fluorescenza sfocata possono passare attraverso il foro stenopeico, mentre il raggio di luce all'esterno del piano focale converge davanti o dietro la piastra stenopeica e non può entrare nel rilevatore attraverso il foro stenopeico. L'immagine rilevata proviene dal piano focale, quindi la qualità dell'immagine finale è notevolmente migliorata.
Grazie ai vari vantaggi e alla praticità della microscopia confocale a scansione laser, è attualmente un assistente sperimentale indispensabile nei campi della biologia cellulare, della botanica e della ricerca cellulare ad alta precisione. Allo stesso tempo, nei futuri centri di ricerca scientifica, costituirà lo strumento di ricerca più basilare e fondamentale.
