La microscopia a fluorescenza differisce dalla microscopia convenzionale
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa per irradiare l'oggetto da ispezionare, in modo che l'oggetto emetta luce, quindi osservare l'oggetto al microscopio. Viene utilizzato principalmente per le cellule di immunofluorescenza. È composto principalmente da una sorgente luminosa, un sistema a piastre filtranti e un sistema ottico per osservare l'immagine fluorescente del campione attraverso l'ingrandimento dell'oculare e della lente dell'obiettivo. Diamo un'occhiata alla differenza tra questo microscopio a fluorescenza e un normale microscopio ottico.
1. Guarda il metodo di illuminazione
Il metodo di illuminazione del microscopio a fluorescenza è generalmente episcopico, vale a dire che la sorgente luminosa viene proiettata sul campione in esame attraverso la lente dell'obiettivo.
2. Guarda la risoluzione
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa e la lunghezza d'onda è relativamente corta, ma la risoluzione è superiore a quella dei normali microscopi ottici.
3. La differenza nel filtro
I microscopi a fluorescenza utilizzano due filtri speciali, che vengono utilizzati davanti alla sorgente luminosa per filtrare la luce visibile e utilizzati tra la lente dell'obiettivo e l'oculare per filtrare i raggi ultravioletti, che possono proteggere gli occhi umani.
Il microscopio a fluorescenza è anche un tipo di microscopio ottico, principalmente perché la lunghezza d'onda eccitata dal microscopio a fluorescenza è breve, quindi questo porta alla differenza nella struttura e nell'uso tra il microscopio a fluorescenza e il microscopio ordinario. La maggior parte dei microscopi a fluorescenza ha una buona funzione di catturare la luce debole, quindi in condizioni di fluorescenza estremamente debole, anche la sua capacità di imaging è buona. Insieme al continuo miglioramento dei microscopi a fluorescenza negli ultimi anni, anche il rumore è stato notevolmente ridotto. Pertanto vengono utilizzati sempre più microscopi a fluorescenza.
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Conoscenza della microscopia a fluorescenza fotonica
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è: nel caso di un'elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire due fotoni a lunghezza d'onda lunga contemporaneamente ed emettere un fotone a lunghezza d'onda più corta dopo una breve durata del cosiddetto stato eccitato; l'effetto è lo stesso che si ottiene utilizzando un fotone con una lunghezza d'onda pari alla metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare le molecole fluorescenti. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni. Per non danneggiare le cellule, la microscopia a due fotoni utilizza laser pulsati con modalità bloccata ad alta energia. Il laser emesso da questo laser ha un'energia di picco elevata e un'energia media bassa, la sua larghezza di impulso è di soli 100 femtosecondi e la sua frequenza può raggiungere da 80 a 100 megahertz. Quando si utilizza una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni del laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione di due fotoni si verifica solo nel punto focale della lente dell'obiettivo, quindi la il microscopio a due fotoni non richiede un foro stenopeico confocale, il che migliora l'efficienza di rilevamento della fluorescenza.
Nei fenomeni di fluorescenza generali, a causa della bassa densità di fotoni della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone allo stesso tempo e quindi emettere un fotone fluorescente attraverso una transizione radiativa, che è fluorescenza a fotone singolo. Per il processo di eccitazione della fluorescenza che utilizza il laser come sorgente luminosa, può verificarsi una fluorescenza a due fotoni o anche a più fotoni. In questo momento, l'intensità della sorgente luminosa di eccitazione utilizzata è elevata e la densità dei fotoni soddisfa i requisiti delle molecole fluorescenti che assorbono due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo di un laser generale come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni non è ancora sufficiente per produrre il fenomeno dell'assorbimento di due fotoni. Di solito viene utilizzato un laser pulsato a femtosecondi e la sua potenza istantanea può raggiungere l'ordine dei megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è inferiore alla lunghezza d'onda della luce di eccitazione, il che equivale all'effetto prodotto dall'eccitazione a metà della lunghezza d'onda di eccitazione.
La microscopia a fluorescenza a due fotoni presenta molti vantaggi:
1) La luce a lunghezza d'onda lunga è meno influenzata dalla diffusione rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta e penetra facilmente nel campione;
2) Le molecole fluorescenti all'esterno del piano focale non vengono eccitate, in modo che più luce di eccitazione possa raggiungere il piano focale, in modo che la luce di eccitazione possa penetrare nei campioni più profondi;
3) La luce del vicino infrarosso a lunghezza d'onda lunga è meno tossica per le cellule rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta;
4) Quando si utilizza un microscopio a due fotoni per osservare i campioni, il fotosbiancamento e la fototossicità si verificano solo nel piano focale. Pertanto, la microscopia a due fotoni è più adatta della microscopia a singolo fotone per l'osservazione di campioni spessi, per l'osservazione di cellule viventi o per esperimenti di fotosbiancamento spot.
Conoscenza della microscopia confocale a fluorescenza
Il principio di base della microscopia confocale a fluorescenza: il campione viene irradiato da una sorgente luminosa puntiforme e sul piano focale si forma un piccolo punto luminoso ben definito. Dopo che il punto è stato irradiato, la fluorescenza emessa viene raccolta dalla lente dell'obiettivo e rimandata al divisore di fascio composto da uno specchio dicroico lungo il percorso di illuminazione originale. Il divisore di fascio invia la fluorescenza direttamente al rilevatore. Davanti alla sorgente luminosa e al rilevatore è presente un foro stenopeico, chiamato rispettivamente foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevazione. La dimensione geometrica dei due è la stessa, circa 100-200nm; rispetto allo spot luminoso sul piano focale, i due sono coniugati, cioè lo spot luminoso attraversa una serie di lenti, e infine può essere focalizzato contemporaneamente sul foro stenopeico di illuminazione e su quello stenopeico di rilevazione. In questo modo la luce proveniente dal piano focale può convergere nell'ambito del foro di rilevamento, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata all'esterno del foro di rilevamento e non può essere ripresa. Il laser scansiona il campione punto per punto, e il tubo fotomoltiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene punto per punto anche l'immagine confocale del corrispondente punto luminoso, che viene convertita in un segnale digitale e trasmessa al computer, e infine aggregata in un chiaro immagine confocale dell'intero piano focale sullo schermo.
Ciascuna immagine del piano focale è in realtà una sezione trasversale ottica del campione e questa sezione trasversale ottica ha sempre un certo spessore, noto anche come sezione ottica sottile. Poiché l'intensità della luce nel punto focale è molto maggiore di quella nel punto non focale, e la luce sul piano non focale viene filtrata dal foro stenopeico, la profondità di campo del sistema confocale è approssimativamente zero e la scansione lungo il L'asse Z può realizzare la tomografia ottica, formando una fetta ottica bidimensionale nel punto focalizzato del campione da osservare. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), l'immagine tridimensionale del campione può essere ottenuta accumulando immagini bidimensionali di strati continui ed elaborate da uno speciale software per computer.
Cioè, il foro stenopeico di rilevamento e quello della sorgente luminosa sono sempre focalizzati sullo stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata all'esterno del piano focale non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
La semplice espressione del principio di funzionamento del laser confocale è che utilizza la luce laser come sorgente luminosa. Sulla base dell'imaging tradizionale del microscopio a fluorescenza, aggiunge un dispositivo di scansione laser e un dispositivo di messa a fuoco coniugata ed è un sistema per l'acquisizione e l'elaborazione di immagini digitali attraverso il controllo computerizzato.
